藥學(xué)分子生物學(xué)：第十章 外源基因表達(dá)與基因工程藥物1

1、第十章外源基因表達(dá)與基因工程藥物2005年全世界約有糖尿病患者1.8億,我國約6000萬。治療糖尿病特效藥胰島素。1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。第一節(jié) 概述胰島素人生長激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素 EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體基因工程藥物基因工程的產(chǎn)物：多彩小魚轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小豬辣椒香蕉藍(lán)色玫瑰黑籽番茄基因表達(dá)指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生其蛋白產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生其RNA產(chǎn)物的過程。外源基因表達(dá)利用細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控

2、系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，進(jìn)而翻譯成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過程。DNA(基因)mRNA 蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯基本概念重組DNA技術(shù)采用各種酶將各種外源DNA進(jìn)行體外的切割與拼接構(gòu)成DNA嵌合體的技術(shù)。分子克隆（基因克?。⒆鳛楣w的重組DNA分子置于與其毫無親緣關(guān)系的受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程?？寺?“Clone”源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖?，F(xiàn)在指生物體通過細(xì)胞進(jìn)行的無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群，簡稱為“無性繁殖”?？筛鶕?jù)其研究或操作的對象分為基因克隆、細(xì)胞克隆和個體克隆三大類。基因克隆是指在分子(DNA)水平上開展研究工作以獲得大量的相同

3、基因及其表達(dá)產(chǎn)物；細(xì)胞克隆則是在細(xì)胞水平上開展研究工作以獲得大量相同的細(xì)胞；個體克隆則是經(jīng)過一系列的操作產(chǎn)生一個或多個與親代完全相同的個體，如克隆羊等。將不同的生物基因（供體）在體外剪切、組合并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后引入原先沒有這類基因的微生物或細(xì)胞（受體）內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，合成編碼該基因的蛋白質(zhì)?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA重組技術(shù)（DNA recombinant Tech)?；蚬こ蹋╣ene engineering）外源基因表達(dá)基本類型根據(jù)宿主細(xì)胞不同：原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞生成的部位不同：胞內(nèi)表達(dá)、定位表達(dá)

4、、分泌表達(dá)。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的溶解狀況不同：可溶性表達(dá)、包涵體表達(dá)。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)狀況不同：非融合表達(dá)；融合表達(dá)。1) 重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝。 跨越天然物種屏障，將原核和真核生物、植物和動物，造福人類，在過去人們難以置信的事情，現(xiàn)在已成為現(xiàn)實(shí)?；蚬こ痰闹卮笠饬x（2）利用重組DNA技術(shù)可以在體外大量擴(kuò)增、純化人們感興趣的基因，研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。 正常人類生命活動的分子機(jī)制；人類各種疾病發(fā)生的分子機(jī)理；人類各種疾病如遺傳性疾病、腫瘤、肥胖、心血管疾病、傳染病等病因的查明、診斷、治療和預(yù)防。藥物的研發(fā)和生產(chǎn)；疾病模型的建立；人類的營

5、養(yǎng)、健康、長壽和保?。▉喗】担?）醫(yī)學(xué)上應(yīng)用更為廣泛，涉及各領(lǐng)域 本章節(jié)的地位：現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)（生物工程）基因工程基因克隆第二節(jié) 外源基因表達(dá)基本過程Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics181、目的基因的獲得2、目的基因與表達(dá)載體的重組3、重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞及其篩選與確認(rèn)4、目的基因的表達(dá)第二節(jié) 外源基因表達(dá)的基本步驟基因工程的主要步驟1. 從生物有機(jī)體的基因組中，分離出帶目的基因的DNA片段目的基因的獲得。2. 將帶目的基因的外源DNA片段，連接到能自我復(fù)制的載體分子上，形成重組DNA分子 DNA分子重組。3.

6、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入。4. 篩選獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞進(jìn)行克隆分子克隆。5. 克隆基因的表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)基因表達(dá)。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics20連接含重組子的陽性克隆載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性克隆DNA重組體+受體細(xì)胞圖3-10 DNA 分子克隆的基本步驟 分、切、接、轉(zhuǎn)、篩Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics21 （一）從基因文庫中獲?。ǘ┠孓D(zhuǎn)錄法（三）人工合成DNA片段（四）直接從染色體DNA中分離目的基因一、目的

7、基因的獲取Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics22制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接，才能進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。載體大都經(jīng)過改造，攜帶有某些選擇性標(biāo)記和克隆位點(diǎn)的遺傳信息等。在常用的克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件（DNA序列）即成為表達(dá)載體，這些載體不僅可以攜帶外源基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且還可以使外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。 二、 載體的選擇載體（Vector） 載體(vector)是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA 。 大多

8、數(shù)的DNA片段不具備自我復(fù)制能力，為了能夠在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，就必須將DNA片段連接到一種具有自我復(fù)制能力的DNA分子上，這種DNA 分子就是載體。常用的載體：質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體分類按載體來源分為:質(zhì)粒噬菌體病毒按載體用途分為:克隆載體表達(dá)載體按載體的宿主細(xì)胞分為:原核克隆/表達(dá)載體真核克隆/表達(dá)載體作為載體的條件 能獨(dú)立復(fù)制具備多個限制酶的識別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))具有遺傳表型或篩選標(biāo)記有足夠的容量以容納外源DNA片段。載體DNA中均有一段非必需區(qū)，將外源基因插入 該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。克隆載體以擴(kuò)增DNA片段為目的，并不需要得到目的基因所編碼蛋白質(zhì)的載體，適用于外源基因的重組、

9、克隆、復(fù)制與保存；克隆載體常帶有一個松弛型復(fù)制子，一個多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記分類：質(zhì)粒、噬菌體、黏性質(zhì)粒、M13噬菌體、酵母載體、真核細(xì)胞病毒載體1.常用的克隆載體質(zhì)粒和噬菌體常用于原核細(xì)胞為宿主的分子克隆，病毒則使用于真核細(xì)胞為宿主的克隆 1. 質(zhì)粒（plasmid ）是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。大腸桿菌的質(zhì)粒載體氨芐青霉素抗性基因：ampr；四環(huán)素抗性基因：tetr；DNA復(fù)制起點(diǎn)：ori 2022/7/24Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics31pUC18、pUC19質(zhì)粒載體用質(zhì)

10、粒構(gòu)建重組DNA分子（二）表達(dá)載體能使外源基因在宿主細(xì)胞 中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的功能性載體。itemClick to edit text1.很強(qiáng)啟動子，能被宿主RNA聚合酶識別2.很強(qiáng)終止子3.啟動子只有在誘導(dǎo)狀態(tài)時才能啟動轉(zhuǎn)錄4.起始密碼和SD序列處在合適距離5.需復(fù)制原點(diǎn)，在載體內(nèi)插入人工組成的多克隆位點(diǎn)具備條件2. 噬菌體DNA線狀雙鏈DNA，適于做大片段基因的載體。噬菌體 組成特點(diǎn)： 雙鏈線狀DNA分子， 全長50kb， 含65個基因， 在其分子兩端各含有12個堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。用噬菌體DNA構(gòu)建重組DNA分子病毒載體 質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿

11、足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細(xì)胞的載體。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。病毒載體 目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。 （二）重組基因操作的工具基因的剪刀限制性核酸內(nèi)切酶基因的針線DNA 連接酶載體 （如質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等） 基因的運(yùn)輸工具一把特殊的剪刀-限制性內(nèi)切酶

12、的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE) 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： 型酶、型酶、 型酶限制性核酸內(nèi)切酶命名：大腸桿菌：Escherichia coli；EcoR(E：屬名；co：種名；R：株；：發(fā)現(xiàn)次序)；流感嗜血菌：Haemophilus influenzae; HindIII限制酶（型

13、）特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷回文序列：是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對稱;限制性內(nèi)切酶能識別特定的堿基序列限制酶切出的末端粘性末端（sticky end）：兩條鏈上的斷裂位置是交錯的、但又是圍繞著一個軸線對稱排列，其結(jié)果產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的單鏈末端，這種單鏈末端由于可以互補(bǔ)成雙鏈結(jié)構(gòu)，所以稱為粘性末端。平末端（blunt end）: 在識別序列內(nèi)同一位置上的核苷酸處進(jìn)行切割，產(chǎn)生的DNA片段不帶粘性末端而是沒有單鏈突出的平齊末端。作用特點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵EcoR黏性末端黏性末端 作用特點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵Sma平末端 平末端限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA 分子的

14、構(gòu)建粘性末端連接方式：(1) 單酶切 (2) 雙酶切雙酶切Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目 錄Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連單酶切定向克隆將目的基因按正確的方向插入載體的方法插入片段及載體兩端具有兩個相應(yīng)的能夠產(chǎn)生粘性末端的酶進(jìn)行酶切2. 平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體

15、限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連目 錄3. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體目 錄4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的

16、酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 錄同裂酶(異源同工酶)：凡來源不同但識別和切割同樣的核苷酸序列的限制性酶。同尾酶：來源、識別順序、切割方式不同，但所生成的限制性片段是相同的粘性末端“分子縫合針” DNA連接酶1種類 ： Ecoli DNA連接酶 T4 DNA連接酶2作用：恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間 的磷酸二酯鍵。3作用原理：催化磷酸二酯鍵形成1.E.coli DNA連接酶或T4DNA連接酶恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵2.T4DNA連接酶T4 D

17、NA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶3.連接酶類型總結(jié)類型EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA限制酶和連接酶的發(fā)現(xiàn)使基因工程從理論走向了實(shí)驗(yàn)室3.基因與載體重組及其策略基因重組目的基因與載體分別經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶剪切，再通過DNA連接酶，將目的基因與載體以3，5-磷酸二酯酶連接形成重組體體外重組體構(gòu)建策略引物設(shè)計：加內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)同種內(nèi)切酶酶切載體PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DNA連接酶Zhejiang Provincial Key Lab of Medi

18、cal Genetics69(一)粘性末端連接目的基因和載體的連接（重組體構(gòu)建）本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點(diǎn)70粘性末端DNA重組體的構(gòu)建 3 HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 3HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 質(zhì)粒 目的基因 目的基因和載體連接 EcoR EcoR 堿性磷酸酶 3HO-G CTTAA-OH 5 5HO -AATTC G-OH 3 退火 DNA連接酶 3HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5p AATTC G AATTC G-OH 3 712) 平末端連接質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)質(zhì)

19、粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶目的基因產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1核酸酶S172人工接頭本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。73本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。通過同聚尾連接74質(zhì)粒 目的基因 33 3ACGTC G 55G CTGCA 33 GnGGGACGTC G 55G CTGCAGGGGn 33 CnCCC 55 CCCCn 3 末端轉(zhuǎn)移酶 dGTP 末端轉(zhuǎn)移酶 dCTP 混合，退火 1）轉(zhuǎn)化細(xì)菌2）體內(nèi)修復(fù)同聚尾連接法構(gòu)建 DNA重組體G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶 目的基因和

20、載體連接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst (一)、連接方式 T4 DNA連接酶既可以連接兩個具有粘性末端的DNA片段，也可以連接兩個具有平端的DNA片段，但是連接后者所需的酶量往往是連接前者的50倍。影響連接效率的因素 適當(dāng)?shù)牟迦肫闻c載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般采用載體：插入片段摩爾數(shù)為1：2-3的比例。（二）載體及插入片段的濃度比（三）、連接溫度和時間 連接反應(yīng)的一項(xiàng)重要參數(shù)是溫度。理論上講連接反應(yīng)的最佳溫度是37，此時連接酶的活性最高。但37時粘性末端分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個

21、既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即1216。（一）宿主細(xì)胞（host cell）能接納重組子并實(shí)現(xiàn)重組子的外源基因擴(kuò)增或表達(dá)的受體細(xì)胞。原核細(xì)胞：大腸埃希菌、芽胞桿菌等。屬于原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞：酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞。屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。三、重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞的特點(diǎn)限制酶缺陷型重組缺陷型蛋白水解酶缺陷易于重組子的導(dǎo)入遺傳穩(wěn)定性好，易培養(yǎng)安全性高功能互補(bǔ)（二）重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相

22、同。重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞方法轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）指噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞，通過特定的途徑，將噬菌體核酸注入宿主細(xì)胞內(nèi)的過程，并使噬菌體核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或子代噬菌體的繁殖。實(shí)質(zhì)是：被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。噬菌體的生活史溶菌生長途徑 (lysis pathway)溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)一、轉(zhuǎn)化 (transfor

23、mation) 由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化，早在1943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。指感受態(tài)細(xì)胞接納外源DNA分子的過程，并使其在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)制、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯（統(tǒng)稱表達(dá)）。DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。如：細(xì)菌感受態(tài)制備、重組體轉(zhuǎn)化及篩選細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備： CaCl2 處理法受

24、體細(xì)菌0-4 0.1M CaCl2 冰浴15-30min細(xì)菌處于感受態(tài)42 ，細(xì)胞熱休克細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增加重組DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞氯化鈣轉(zhuǎn)化法： 將氯化鈣，RNA(或DNA) 混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的鈣顆粒。大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入42作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；又稱為熱休克法。LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O細(xì)胞膨脹：低滲環(huán)境胞膜收縮：低溫環(huán)境離子擴(kuò)散： DNA-Ca2熱休克： 42 1L LB培養(yǎng)基:轉(zhuǎn)化將細(xì)胞懸浮液置于電場中，通過短暫的高壓脈沖電場使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬時的可逆性微孔，

25、而將重組DNA引入細(xì)胞內(nèi)。 電穿孔儀 電穿孔杯 384 電穿孔板電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染(transfection)對于真核生物，轉(zhuǎn)染就是原核生物中轉(zhuǎn)化的同義詞。之所以在真核生物中使用轉(zhuǎn)染這個詞來代替轉(zhuǎn)化，是因?yàn)槿藗冎耙呀?jīng)習(xí)慣了用轉(zhuǎn)化這個詞表示真核細(xì)胞變?yōu)閻盒约?xì)胞。感染（infection） 噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染（infection）。 用經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較

26、麻煩。重組DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞（一）顯微注射法 是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時。此法用于生殖細(xì)胞時，有效率可達(dá)10。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動物就稱為轉(zhuǎn)基因動物，目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠，它可作為繁殖大量后代的疾病動物模型。 1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法將人的生長素基因和牛的生長素基因分別注射到小白鼠的受精卵中，得到了體型巨大的“超級小鼠”，引起整個生物學(xué)界的轟動。這一方法外源DNA整合率高、容量大，DNA長到50kb仍然有效，實(shí)驗(yàn)周

27、期縮短，因而應(yīng)用較廣泛，是制備轉(zhuǎn)基因動物的一種常用方法。（二）DNA-磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過細(xì)胞的作用，培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會顯著提高。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復(fù)性差。（三）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法 帶正電的DEAE-葡聚糖復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。DEAE-葡聚

28、糖僅限于瞬時轉(zhuǎn)染。相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好,但對細(xì)胞有一定的毒副作用,轉(zhuǎn)染時需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS細(xì)胞系（四）陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體（liposome）法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。 近年來用陽離子脂質(zhì)體包裹DNA，形成的脂質(zhì)體可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，方法簡單而有效。（五）電穿孔法 電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時穿孔。 用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力，但所用外加電場的強(qiáng)度、電脈

29、沖的長度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。（六）病毒感染法 病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是通過感染方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector）,將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viral vector）。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics104（一）根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選 1根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志篩選 大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)記的特征（如Ampr 、Tetr等）當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不

30、能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。五、重組體的篩選和鑒定Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1052根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇 某些質(zhì)粒載體如 pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr 抗性基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的MCS，如將外源DNA片段插入BamH識別序列時，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感（Tets ）。這種重組子導(dǎo)入宿主菌后，宿主菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細(xì)菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素對照篩選。五、重組體的篩選和鑒定106Zh

31、ejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics107(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1093-半乳糖苷酶基因失活篩選某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸-肽的DNA片段， IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)-互補(bǔ)，形成完整的-半乳糖苷酶。催化指示劑底物X-gal 形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將

32、無-半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)。 五、重組體的篩選和鑒定 互補(bǔ)利用互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics112Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1134營養(yǎng)標(biāo)記選擇 當(dāng)細(xì)胞生物合成途徑中某個酶的編碼基因失活后，該細(xì)胞成為營養(yǎng)缺陷型，如導(dǎo)入細(xì)胞的重組DNA能彌補(bǔ)缺陷的基因，那么，培養(yǎng)基中就不需補(bǔ)充有關(guān)的營養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽性細(xì)菌。 五、重組體的篩選和鑒定DHFR缺陷型CHO無胸腺嘧啶的培養(yǎng)基二氫葉

33、酸還原酶(DHFR)基因促進(jìn)THF合成DNA重組體遺傳互補(bǔ)Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics115（二）重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選1重組子大小鑒別篩選 2酶切鑒定3PCR篩選法4核酸雜交技術(shù)篩選5. DNA序列分析五、重組體的篩選和鑒定PCR法已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設(shè)計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就可能含有目的的序列。DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析DNA測序 Southern印跡 菌落雜交雞的肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法 Zhejiang Provincial

34、Key Lab of Medical Genetics122外源基因表達(dá)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics123原核表達(dá)系統(tǒng)：表達(dá)載體表達(dá)宿主真核表達(dá)系統(tǒng)：酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)六、目的基因的表達(dá) 目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線5. 目的基因表達(dá) 原核細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)錄:原核生物啟動子Pri

35、bnow box(-10 sequence)Sextama box(-35 sequence)Pribnow box 和Sextama box的距離(16-19bp)啟動子受控制外源基因的翻譯SD序列,核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列與起始密碼子的距離：5-13bpmRNA的結(jié)構(gòu)密碼子的偏愛性5. 目的基因表達(dá) 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄真核生物啟動子TATA box （-25 -30）CAAT box （-70 -80）GC box （-80 -110）上游調(diào)控元件：cAMP應(yīng)答元件、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件、 特異信號應(yīng)答元件增強(qiáng)子沉默子終止子加尾信號翻譯：Kozak序列：CCACCAUGG原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大腸埃希菌表

36、達(dá)載體啟動子lac啟動子：IPTGtrp啟動子：吲哚烯酸t(yī)ac啟動子：IPTGpL啟動子：42T7噬菌體啟動子： T7噬菌體溶原菌載體系列：pGEM系列、pET系列、pMAL系列等。宿主細(xì)胞：大腸埃希菌宿主細(xì)胞的改造1. 通過改變載體的抗性基因或?qū)⑼庠椿虿迦肴旧w 中來控制拷貝數(shù)；2. 通過代謝工程改造宿主細(xì)胞，使之能在細(xì)胞中催化 二硫鍵形成；3. 通過定向突變對蛋白酶進(jìn)行突變防止重組蛋白分解；4. 篩選具有糖基化的大腸桿菌；5. 篩選不同密碼子偏愛性的宿主細(xì)胞；6. 選擇RNase缺陷型的大腸桿菌為受體菌，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌：優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)胞壁的組成簡單，只含有肽聚糖

37、和磷璧質(zhì)，因此在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會混雜有胞被內(nèi)毒素（熱源性脂多糖），而這一點(diǎn)是大腸桿菌無法比擬的。2、能夠大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越細(xì)胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單。3、沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達(dá)產(chǎn)物也不容易形成包涵體。缺點(diǎn)：1、存在限制和修飾系統(tǒng)，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定。2、能自發(fā)形成感受的的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低。3、能夠產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達(dá)產(chǎn)物的大量降解。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)融合蛋白：原核啟動子SD序列原核起始密碼原核結(jié)構(gòu)基因片段真核結(jié)構(gòu)

38、基因原核終止密碼終止子非融合蛋白：原核啟動子SD序列真核起始密碼及結(jié)構(gòu)基因原核終止密碼終止子分泌型蛋白：原核啟動子SD序列信號肽序列真核起始密碼及結(jié)構(gòu)基因原核終止密碼終止子基因工程蛋白的分離純化 精細(xì)純化粗級分離 胞內(nèi)表達(dá)胞外表達(dá)重組蛋白質(zhì)的分離純化美國GE公司蛋白質(zhì)分離純化裝置 上海廈美公司蛋白分離層析系統(tǒng)分部收集器記錄儀蠕動泵梯度混合儀蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性質(zhì) 方 法 電荷（等電點(diǎn)） 離子交換（IEX） 分子量 凝膠過濾（GF） 疏水性 疏水（HIC）反相 （RPC）特異性結(jié)合 親和（AC） 蛋白質(zhì)分離方法的選擇選擇分離純化方法的依據(jù)1.根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物： 發(fā)酵液體積大、濃度低,先濃縮（沉淀、超濾/最常用）。周質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物： E.coli經(jīng)低濃度溶菌酶處理,再用 滲透壓休克法，雜蛋白少，易純化。細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)產(chǎn)物（融合蛋白）： 破菌后的可溶性離心上清液,首選親和層析分離方法（pBG-2 融合表達(dá)），或選用離子交換色譜包涵體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物： 包涵體對蛋白質(zhì)分離純化的影響: 1.很容易與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離,重組蛋白純化較容易完成; 2.包涵體中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物經(jīng)過了一個變性復(fù)性過程,較易形成蛋白產(chǎn)物的錯誤折疊和聚合體。包涵體的分離和重組蛋白質(zhì)的純化步驟: 細(xì)菌收集與破碎 包涵體的分離 洗滌與溶解 變性