結(jié)構(gòu)鑒定-天然藥物化學(xué)課件

1、第二節(jié) 結(jié)構(gòu)研究方法天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)研究難度較大：未知因素太多樣品量少結(jié)構(gòu)復(fù)雜主要借助波譜方法進(jìn)行綜合解析，必要時 結(jié)合化學(xué)降解，衍生物制備等方法。一、化合物的純度測定檢查晶形測定熔點(diǎn)TLC或PPC檢查：一般需要三種系統(tǒng)，且需 用通用顯色劑顯色（如硫酸、磷鉬酸等）。 4.GC或HPLC程序方法初步判斷化合物類型注意觀察樣品在提取、分離過程中的行為。測定有關(guān)理化性質(zhì)，如不同 pH、不同溶劑中的溶解度及層析行為，灼燒試驗(yàn)、化學(xué)定性反應(yīng)等。3.結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研1.分子式測定可采用下列某種方法：元素定量分析分子量測定測定分子式，計(jì)算同位素峰法不飽和度HR-MS確定分子中含有的官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)片斷，或基本骨架計(jì)算不

2、飽和度官能團(tuán)定性及定量分析測定并解析化合物的有關(guān)光譜：如 UV、IR、MS、 1HNMR、13CNMR結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研綜合分析光譜解析及官能團(tuán)定性，定量分析結(jié)果推斷并確定分子的平面結(jié)構(gòu)與已知化合物進(jìn)行比較或化學(xué)溝通（化學(xué)降解、衍生物制備或人工合成）。推斷并確定分子的立4.進(jìn)一步確定立體結(jié)構(gòu)測定 CD 或 ORD 譜體結(jié)構(gòu)（構(gòu)型、構(gòu)象）測定 NOE 或 2DNMR 譜進(jìn)行 X-ray 人工合成二結(jié) 構(gòu) 研 究 的 主 要 程 序已知化合物：與標(biāo)準(zhǔn)品對照：共薄層（三種以上系統(tǒng)）：Rf值相同 共熔點(diǎn)共紅外無標(biāo)準(zhǔn)品：與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照mp, IR, UV, MS, 1H NMR, 13CNMR未知化合物確定分

3、子式、分子量：元素分析、質(zhì)譜、1HNMR、13CNMR譜功能基、基本骨架和結(jié)構(gòu)式確定：1、定性反應(yīng)3、化學(xué)反應(yīng)2、反應(yīng)薄層3、波譜法三、結(jié)構(gòu)研究中采用的主要方法（一）確定分子式，計(jì)算不飽和度元素定量分析分子量測定元素定量分析：C、H、N，O分子量測定：冰點(diǎn)下降法（固體物質(zhì)）、沸點(diǎn)上升法（液體物質(zhì)）、粘度法、凝膠過濾法，質(zhì)譜法（MS）。同位素峰度比法化合物M+,M+1+,M+2+峰的強(qiáng)度為定值高分辨質(zhì)譜（HRMS）法物質(zhì)的質(zhì)量精確測定到小數(shù)點(diǎn)后第4位4.不飽和度的計(jì)算：C25H30O15u=25-30/2+0/2+1=11CnHmOvHOHOH OHHOOOHOOH OHOHHOHOHOOHHH

4、HH OHu=IV- I+ III+122u=2n+2-m2u= 225+2-30=112（二）天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定主要波譜方法紅外光譜紫外光譜質(zhì)譜核磁共振譜旋光譜及圓二色譜X-射線衍射1. 紅外光譜（IR, Infra-red Spectrometry）原理：有機(jī)分子吸收紅外光（5004000 cm-1）后 產(chǎn)生化學(xué)鍵振動而形成的吸收光譜。作用：功能基的確定，如羰基、雙鍵、芳環(huán)等應(yīng)用：未知物鑒別、化學(xué)結(jié)構(gòu)確定 化學(xué)反應(yīng)檢查、區(qū)別異構(gòu)體純度檢查、質(zhì)量控制 環(huán)境污染監(jiān)測等NCH3HOOCH2OHOCCH消旋山莨菪堿OHAromatic ringC=O特征區(qū)：40001250 cm-1確定功能基團(tuán)30

5、00 cm-12900 cm-11900-1650 cm-11690-1600 cm-1特征峰疏，易辨認(rèn)OH、NH2、COOHC-H 伸縮振動 C=O 伸縮振動 C=C 伸縮振動 C-H 彎曲振動烯或芳環(huán)取代情況吸收峰密集，結(jié)構(gòu)微小變化敏感1000-650cm-1指紋區(qū)：1250 400 cm-1區(qū)別兩個化合物是否相同2. 紫外光譜（UV, Ultra-Violet Spectrometry）原理：有機(jī)分子吸收紫外光（200-500nm）后產(chǎn) 生電子振動而形成的吸收光譜。應(yīng)用：主要用于測定分子內(nèi)的共軛系統(tǒng)。飽和烴：無紫外吸收不飽和脂肪烴： 孤立雙鍵：200 nm共軛雙鍵：200 nm芳環(huán)：取代

6、苯環(huán)200 nm黃酮類化合物386200300400500268333MeOHMeONaHOCH3異環(huán)共軛雙烯240, 250, 260 nmHOCH3孤立雙鍵205 250 nm 微弱吸收HOCH3同環(huán)共軛雙烯285 nmHOOCH3, -不飽和羰基242 250 nmOOOMeRha(1-2)GlcOMeOOH3. 質(zhì)譜（MS, Mass Spectrometry）原理：樣品在質(zhì)譜儀中生成陽離子，在穩(wěn)定磁場 中按質(zhì)核比（m/z）順序進(jìn)行分離，檢測器紀(jì)錄。質(zhì)譜可以給出化合物的準(zhǔn)分子離子峰、分子離子 峰及碎片峰，借此推斷化合物的結(jié)構(gòu)。用途：確定化合物分子量，糖、苷分子中單糖的連接順序。質(zhì)譜的種

7、類：EI-MS：電子轟擊質(zhì)譜 Electron impact ionizationCI-MS：化學(xué)電離質(zhì)譜 Chemical ionizationFI-MS：場致電離質(zhì)譜 Field ionizationFD-MS：場解析電離質(zhì)譜 Field desorption ionizationFAB-MS：快速原子轟擊電離質(zhì)譜 Fast atom bombardment ionizationESI-MS：電噴霧電離質(zhì)譜 Electrospray ionizationMALDI-MS：基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜API-MS：大氣壓電離質(zhì)譜（1）電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）electron impact io

8、nization樣品經(jīng)高溫（300C）氣化，氣態(tài)分子受一定能 量的電子沖擊而電離和裂解產(chǎn)生各種陽離子。 分子離子峰；碎片峰。應(yīng)用：苷元、易氣化的小分子CH2=CH2m/z 28M+（2）場解析質(zhì)譜（FD-MS）原理：樣品不經(jīng)氣化與載體表面形成薄膜， 在強(qiáng)電場作用下電離為陽離子。應(yīng)用：難揮發(fā)，熱不穩(wěn)定的糖、肽等（3）快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）原理：樣品與甘油混合由載體引入，分子經(jīng)快速 原子氬轟擊后進(jìn)入質(zhì)譜儀。應(yīng)用：高分子、熱不穩(wěn)定、強(qiáng)極性的糖、肽等M-rhaM-rha-glcM-rha-rha-glc M-rha-rha苷元M+Na+M-ribM+H+M-rib-rha+M-rib-rha-

9、glc+6-C- 糖 （glc） M-163 甲基5-C-糖（rha）M-147 5-C- 糖 （ara） M-133FAB-MS：m/z:611M-1+, 465 (M-147), 303 (M-147-163)OHOHOCH3OOHOHHOOHOO HOOHOOOHOHOHOOHOOOHOHOHOHOOCH3OOHHOOHHO4.電噴霧質(zhì)譜 ESI-MSElectro spray ionization通過電場產(chǎn)生帶電液滴，樣品離子通過離子蒸 發(fā)后進(jìn)行分析。電離過程幾乎不產(chǎn)生碎片，適合混合物分析；多肽、蛋白等可有多個質(zhì)子化點(diǎn)，特別適合；受溶劑、酸度、雜質(zhì)等因素影響很大，盡可能用甲 醇為溶劑；

10、質(zhì)譜圖中多出現(xiàn)M+Na+、 M+K+、 M+NH4+、 M+Cl-峰，可據(jù)此判斷準(zhǔn)分子離子峰；必要時建議同時進(jìn)行正、負(fù)離子掃描。ESI-TOF+-MSESI-TOF-MSM+H+M+Na+M-H+分子量：452根據(jù)樣品結(jié)構(gòu)確定檢查手段：小分子，易揮發(fā)化合物-GC-MS；小分子，熱穩(wěn)定化合物-EI；m/z 8鄰位偶合以及同碳偶合鄰位偶合常數(shù)二面角同碳偶合遠(yuǎn)程偶合4. NOE效應(yīng)（nuclear overhauser effect）NOE差譜：普通1H譜與照射特定質(zhì)子所得的譜相減， 只保留被增強(qiáng)的峰。空間距離 0.4 nm（二）核磁共振碳譜（13C-NMR）13C信號的裂分：符合n+1規(guī)律q（CH

11、3）、t（CH2）、d（CH）、s（-C-）。全去偶譜1. 化學(xué)位移 0210碳原子雜化： sp3 sp sp2碳核周圍電子云密度：密度， ，誘導(dǎo)效應(yīng)：電負(fù)性， 共軛效應(yīng)空間效應(yīng)重原子效應(yīng)分子內(nèi)氫鍵取代基數(shù)目介質(zhì)效應(yīng)溫度效應(yīng)（三）二維核磁共振（2D-NMR）1H-1H COSYHMQC（HSQC）HMBCNOESYTOCSY對角線峰對稱交叉峰1. 1H-1H COSY（COrrelation SpectroscopY） 同一自旋偶合體系里質(zhì)子之間的偶合相關(guān)。2. HMQC：異核多量子相干譜 （heteronuclear multiple quantum coherence ）直接鍵連的C-H間

12、的偶合相關(guān)。3. HMBC：異核多鍵相干譜（Heteronuclear Multiple Bond Connectivity）提供兩鍵或大于兩鍵，主要是三鍵的C-H偶合信 息，抑制了直接偶合信息（1JCH） ，建立C-C間的 關(guān)聯(lián)，甚至越過氧、氮或其他原子的官能團(tuán)間的關(guān) 聯(lián)，特別解決由于屏蔽效應(yīng)難以解釋的季碳?xì)w屬問 題。4. TOCSY接力相干轉(zhuǎn)移（TOtal Correlation SpectroscopY）一個自旋體系中所有自旋都是相互偶合的，TOCSY譜 中交叉峰來自接力相干轉(zhuǎn)移。只要從一個偶合鏈中選擇一個分辨良好、不與其他質(zhì) 子信號重疊的信號開始，就可以解析該偶合鏈中的所有質(zhì)子信號。一

13、維TOCSY，Homonuclear Hartmann-Hann二維TOCSY甾體皂苷的2D-TOCSY譜EDBACOOHOOHOHOH OHOHOCH3OOHOOOHO OO OHOOOHOH OHFOH OHOH OOOHHOCH3OOOHOOEOHOHOODFOHOHO OOHOHOHBO OOH OHOHCH3甾體皂苷的1D-TOCSY譜5. NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) ROESY (Rotating-frame Overhauser EffectSpectroscopy) 旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系下的NOE實(shí)驗(yàn)ROESY適用于所有化

14、合物NOESY適用于生物大分子，小分子不適用。 空間距離 0.45 nm有時會出現(xiàn)COSY信號COSYCOSYCOSYGNOESY：two-dimensional nuclear Overhausereffect correlation spectroscopy, 二維核歐沃豪斯 效應(yīng)譜OESY spectrumGlc-13-OMe7-OMeH-2H-4H-5H-8OOHOCH3OH3COOON OHOrhaOHCH2OHH 2H 4H 5H 8H 1OOHO2458五、旋光譜與圓二色譜平面偏振光分解為兩個周期和振幅相同，方向 相反（左、右）的圓偏振光。平面偏振光在手性環(huán)境中傳播特性：圓雙折射

15、性-左旋、右旋圓偏振光的折射率不同。兩種 圓偏振光傳播速度不同， 平面偏振光角度旋轉(zhuǎn)比旋光度-使用單一波長光源（鈉光D）；旋光光譜-使用連續(xù)波長光源圓二色性-左旋、右旋圓偏振光吸收系數(shù)不同，導(dǎo)致圓偏振光振幅發(fā)生改變，形成橢圓偏振光。圓二色譜-吸收系數(shù)差=L-R，化合物生色團(tuán)附近摩 爾橢圓度=3300 1. 比旋光度（specific optical rotatory）2.C8H17OH5-膽甾烷-3酮（4）C8H17OOH譜線與5相似H5-膽甾烷-3酮（5）OH3.圓二色譜解析方法經(jīng)驗(yàn)規(guī)則：八區(qū)律、螺旋規(guī)則、扇形規(guī)則半經(jīng)驗(yàn)方法：激發(fā)態(tài)手征性量化計(jì)算：ORD、ECD、VCD計(jì)算1.八區(qū)律規(guī)則（1

16、）飽和環(huán)酮OOHHOO106H12Oneo-克羅烷二萜6. 單晶X射線衍射（X-ray diffraction method） X射線為短波長電磁波。當(dāng)X射線照射在被測樣品上時，因光的干涉作用而產(chǎn)生衍射效應(yīng)。 單晶體是指樣品中所含分子（原子或離子）在三維空間中呈規(guī)則、周期排列的一種固體狀態(tài)。純度較高的化學(xué)成分在合適的溶劑系統(tǒng)中經(jīng)重 結(jié)晶可得到適合X射線衍射使用的單晶樣品，其 大小約為0.5mm左右。X射線 照射單晶 樣品衍射 信息計(jì)算機(jī) 數(shù)據(jù)處理分子中 原子排列分子晶胞堆積圖分子立體結(jié)構(gòu)投影圖單晶X射線衍射特點(diǎn)：只需一顆單晶體(約1/4-1/6mg)，微量成分結(jié)構(gòu)鑒定；對藥物中共晶樣品可給出準(zhǔn)

17、確、定量的分析結(jié)果；可獲得藥物分子的絕對構(gòu)型（全新骨架）；可以準(zhǔn)確地計(jì)算出被測化合物的構(gòu)象信息：分子骨架各環(huán)的船或椅式構(gòu)象、環(huán)與環(huán)間的順反聯(lián)接方式、 環(huán)自身的平面性質(zhì)、環(huán)與環(huán)間的扭轉(zhuǎn)角、側(cè)鏈的相對取向位置、大環(huán)構(gòu)象等?？梢詼?zhǔn)確地計(jì)算出藥物分子的氫鍵、鹽鍵、配位鍵 的成鍵方式和數(shù)值?？梢源_定天然藥物中水溶性大分子（蛋白質(zhì)、多肽、多糖類等）的準(zhǔn)確三維結(jié)構(gòu)，結(jié)晶豬胰島素。利用單晶X射線衍射測定分子絕對構(gòu)型方法：含重原子的分子，利用分子中所含重原子的X射線反常散射(色散)效應(yīng)，準(zhǔn)確測定分子構(gòu)型。不含重原子的分子（只含C、H、O、N原子），使用CuK或MoK輻射直接法：測量反常散射點(diǎn)對的衍射數(shù)據(jù)，如青蒿素。間接法：利用結(jié)構(gòu)中已知構(gòu)型的基團(tuán)或引入另一個已知 絕對構(gòu)型的手性分子。如重結(jié)晶中，引入手性試劑（如D或 L-酒石酸等）形成共晶的單晶體，以手性試劑的已知構(gòu)型 為參照，得到待測分子的絕對構(gòu)型。CH3 NOH OHOCH3*OHO經(jīng)1D和2D NMR數(shù)據(jù)分析確定rohitukine平面結(jié)構(gòu)，哌啶環(huán)上有兩個手性中心。HOCH3OH