有關紫杉醇生產的影響因素與對策甄選

1、精品 word. / 4doc 可編輯有關紫杉醇生產的影響因素與對策 .（優(yōu)選）有關紫杉醇生產的影響因素與對策紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉科（Taxaceae紅豆杉屬（Taxus）植物樹皮、針葉中分 離出的一種四環(huán)二萜酰胺類化合物 , 它能有效地治療晚期卵巢癌 , 乳腺癌和其它 癌癥, 被稱為是過去幾十年中發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物。 1992 年12月29日, 美國 FDA正式批準紫杉醇作為治療晚期卵巢癌的新抗癌藥物 （商品名為Paclitaxel）。由 于紫杉醇在植物體中的含量相當?shù)停蠹s從3 6棵60 100年生大樹的樹皮中才能 提取到1g紫杉醇，可治療一個癌癥患者。目前全球每年200kg紫

2、杉醇的消耗量意味 著要砍伐 100萬棵紅豆杉大樹 , 隨著紫杉醇應用范圍的擴大 , 其需求量必然會逐 年增加，而紅豆杉樹生長速度相當慢，直徑20cm的樹需生長100年！因此，伐樹 生產紫杉醇的方法不僅會嚴重破壞該樹的長期生存和分布 , 也根本無法滿足人們 對紫杉醇的需求。尖銳的供需矛盾在醫(yī)學、化學和生物學領域中引起了一場非同 尋常的廣泛研究 , 以增加這種化合物的來源。目前生產紫杉醇的主要方法紫杉醇的生產方法主要是提取分離和化學合成，提取分離的方法按來源不同 又可分為三大類 : 從植物中分離提取、從真菌中分離提取及從培養(yǎng)細胞中分離提 取。直接從紅豆杉科植物中分離提取 紫杉醇含量與種、部位、生長

3、年限、生長環(huán)境等因素有關。在所有紅豆杉中短葉紅豆杉中紫杉醇含量最高；從生長時間上看，生長時間越長的器官或組織紫 杉醇含量越高；從生長環(huán)境上看，生長在陰處的樹皮比暴露在日光下的高；就部 位來看，一般樹皮中紫杉醇含量較高， 短葉紅豆杉樹皮中紫杉醇含量可達 0.069%。 據估算，從2000 3 00（棵稀有的紫杉樹皮中只能提取1 kg紫杉醇，而對1例病人制 備充足的藥物需 3 4棵百年的老紅豆杉樹。這要求人工栽培的紅豆杉品種紫杉醇 含量高、生長迅速。 目前，曼地亞紅豆杉能相對較好地滿足這些要求，它是一 個雜交品種，生長迅速3 5day后可收獲兩次枝葉，其針葉中紫杉醇含量為0.017% 0.046%

4、。因此，人工種植該品種生產紫杉醇的成本不會低，但是，選育優(yōu)良品 種提取紫杉醇無疑是一個有價值的研究方向。直接從紫杉醇產生菌中提取 紫杉醇產生菌主要是一些紅豆杉的內生真菌。真菌中最高紫杉醇含量為 185.4g/ L,可見，當前利用微生物發(fā)酵方法產生紫杉醇的量很低，難以達到工業(yè)化生 產的要求。而且，真菌自身合成紫杉醇的途徑還未見報道，自身是否存在紫杉醇 的合成途徑還需進一步研究探索。此生產方法的前景還不明朗。化學合成法化學合成是生產藥物的一條重要途徑，許多天然藥物 （如一些抗生素 ） 除了可 從生物體內提取外，還可通過化學的方法合成。紫杉醇的藥效被發(fā)現(xiàn)以來，其化 學合成的方法一直受到重視并得到很多

5、的研究探索。 迄今為止，在生產上有價 值的紫杉醇的全合成尚未取得成功。紫杉醇結構復雜，母核有9個手性中心，因 此應有 2 048個非對映異構體，紫杉醇的半合成是以天然來源的 baccatin 或 10-去 乙酰baccat in為原料，通過13位酯化得到紫杉醇或其它半合成衍生物。此法首先 合成側鏈，然后把側鏈接到baccatin或10-去乙酰baccatin上去。紫杉醇的半合成 法的問題主要在于： 1） 合成原料在植物中含量不高，分離成本較高。 2） 每一步 反應得率低，而且有時會碰到選擇性較差的問題。所以，無論是全合成還是半合 成目前都取得了成功，但都難以應用于大規(guī)模的工業(yè)化生產。4 利用紅

6、豆杉細胞培養(yǎng)生產紫杉醇大規(guī)模地培養(yǎng)微生物細胞實現(xiàn)了許多種抗生素的大量生產，極好地滿足了病 人對抗生素的需求，挽救了無數(shù)人的生命?？股厥俏⑸锏拇紊x產物，紫 杉醇是植物細胞的次生代謝產物， 能否通過大規(guī)模的植物細胞培養(yǎng)大量獲取紫杉 醇很有研究價值。就現(xiàn)有的報道來看，這一生產方法受到了許多學者的重視，許 多研究者在高產細胞系的選擇和代謝調控方面進行了大量的卓有成效的研究。 影響紫杉醇生產的幾個因素：1.碳源碳源作為植物生長的基質和能量來源，對細胞生長和次級代謝產物的生產有 很大影響。在短葉紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中，比較了 20g/L的蔗糖、乳糖、半乳糖、 葡萄糖、果糖對細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)半乳糖

7、和蔗糖最有利于細胞生長。在高起 始糖濃度的培養(yǎng)基中，果糖最能刺激紫杉醇的合成。與高起始糖濃度培養(yǎng)的細胞 相比，采用補糖的方法，紫杉醇產量在靜止期可顯著增加。南方紅豆杉細胞對蔗 糖的消耗有一個臨界點，即培養(yǎng)液中總殘留有 1g/L的蔗糖不能被吸收，而培養(yǎng)液 中濃度為30g/L的蔗糖對細胞生長和產物合成最為有利。蔗糖大部分被降解成葡萄 糖和果糖，其中葡萄糖有利于細胞的前期生長以獲得大量的懸浮細胞，在中期添 加果糖有利于細胞培養(yǎng)后期合成紫杉烷類化合物。氮源在氮源組成中，較低的NH4/NO3比有利于細胞的快速生長，而其他無機鹽濃度 與細胞生長之間不存在這種關系。培養(yǎng)基中高濃度的NO3有利于云南紅豆杉愈傷

8、組織的生長，而高濃度的NH4則抑制愈傷組織的生長，但可顯著提高紫杉醇的含 量。在無機氮全部為銨態(tài)氮的處理中，愈傷組織接種 1周后就變成磚紅色，增殖 較少，其生長指數(shù)顯著低于對照，但紫杉醇含量較對照高1倍。光照 在離體無菌培養(yǎng)條件下，細胞處于異養(yǎng)狀態(tài)，且培養(yǎng)基中已經添加了足夠的 碳源，光照并非用來提供光合作用的能量，但是不同的光照時間和光照強度仍然 會對細胞代謝產生一定的影響。 白光對東北紅豆杉愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞中紫 杉醇積累的影響發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時懸浮細胞的生長量是白光培養(yǎng)下的2-3倍，紫杉醇的產量也是白光培養(yǎng)下的 3倍。其原因可能有 2個：一是紫杉醇（二萜）的遠程 前體是甲戊二羥酸（MVA）

9、,而MVA的合成量與甲戊二羥酸酰輔酶 A還原酶（HMGR） 的活性正相關，光照會導致HMGR勺活性降低，最終導致紫杉醇積累的降低；二 是光照會抑制紫杉醇的胞外分泌，從而可能導致胞內合成過程的反饋性抑制。溫度雖然大多數(shù)植物細胞的適宜生長溫度范圍較寬 (22-30C )，但在紅豆杉細胞生 長和紫杉醇合成過程中，適宜溫度還是起著一定作用。低溫處理對紅豆杉細胞懸 浮培養(yǎng)的影響，比較了分別在2、4、6、8C下處理12,24, 36h以及恢復12,24, 36h 對紅豆杉細胞分裂指數(shù)的影響。結果表明，在 2C下處理12H,恢復12h紅豆杉細 胞分裂指數(shù)提高了 115%,說明低溫對其細胞生長具有誘導作用。中

10、國紅豆杉在 24C下培養(yǎng)一段時間后，升高溫度至29C，再培養(yǎng)14-21d時，紫杉醇含量可達到 137.5mg/L,如果21d后仍持續(xù)保持29C，紫杉醇含量可在這一峰值保持42d,由 此可見,溫度與紫杉醇合成途徑之間有明顯的相關性。pH 值培養(yǎng)基pH值在4.87.8時，東北紅豆杉愈傷組織的生長沒有明顯差異。但是培 養(yǎng)基pH值對東北紅豆杉和南方紅豆杉愈傷組織生長、紫杉醇含量與苯丙氨酸解氨 酶活性的影響后，pH值的高低對紅豆杉愈傷組織生長及紫杉醇含量影響很大，且PAL舌性的大小與紫杉醇含量呈正相關。即 PAL舌性高，紫杉醇含量往往也高。這 可能是因為：在PA啲作用下，由苯丙氨酸脫氨基而形成的肉桂酸參

11、與了 Wintersein酸的形成，而Wintersein酸是紫杉醇合成的前體。值得注意的是，有利 于愈傷組織生長的pH值卻不利于紫杉醇的積累，而且往往是愈傷組織生長越好，紫 杉醇含量越低 ;生長狀態(tài)較差的 ,紫杉醇含量反而可能增高。氣體植物細胞在懸浮培養(yǎng)時需要氧氣02，同時也能非光合地固定一定濃度的二氧 化碳，只有O2和CQ的濃度達到某一平衡點時，細胞才會很好地生長，乙烯是植物 細胞在不良刺激下產生的一種防御性氣體 ,對紫杉醇產量的提高不利。 對于漿果紅 豆杉的懸浮培養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)基中維持低濃度的 CQ并移走乙烯，同時提供充足 的02能夠促進細胞生長,增加紫杉醇的產量。 擴大紫杉醇資源的途徑

12、主要有以下幾個：一、進行紅豆杉樹木的扦插、育苗通過優(yōu)株選擇、 品系匹配、 控制授粉進行良種選育 , 繁育出高生長量、 高紫杉 醇含量的雜交種苗。 南方紅豆杉具有的高生物量性狀與北方紅豆杉具有的高抗逆 性狀和紫杉醇高含量性狀通過種間雜交組合 , 有望提高原料植物的紫杉醇生產 力。研究表明，對紅豆杉采用營養(yǎng)袋作基質，用ABT生根粉浸基部12小時，在室 外常規(guī)管理下 , 生根率高達 70%90%,且扦插苗根系發(fā)達 , 占用土地少 , 便于管理 , 移栽成活率高。二、進行紫杉醇的化學合成與半合成全合成紫杉醇。 一般采用兩種合成途徑 , 一種是線性合成法 , 另一種是收斂途 徑。兩種途徑均需要 2530

13、 步復雜的化學反應過程 , 若實現(xiàn)工業(yè)化生產紫杉醇 , 還有一定的距離。半合成紫杉醇。主要是從紅豆杉的針葉中獲得高含量的 10- 去 乙酰漿果赤霉素皿,以此為原料半合成紫杉醇以及同系物taxotere,taxotere的抗 腫瘤作用與紫杉醇相似。在臨床試驗中 , 采用 taxotere 治療晚期腫瘤患者 , 有效 率達 40%。由于紅豆杉針葉產量大、 再生能力強 , 因此 , 半合成紫杉醇的原料是很 豐富的。三、進行紫杉醇的組織培養(yǎng)近年來 , 國內外進行愈傷組織培養(yǎng)的紅豆杉或變種已超過 10 個, 其中大部分 被證實可產生紫杉醇。研究較集中的是歐洲紅豆杉、太平洋紅豆杉、東北紅豆杉 等 , 選作

14、誘導愈傷組織的外植體包括根、莖、葉、樹皮、形成層、大配子體、種 子胚、假種皮、幼苗胚軸等。還有人用發(fā)農桿菌轉化紅豆杉細胞離體培養(yǎng)生產紫 杉醇及其類似物 , 誘導其發(fā)根 , 然后大量培養(yǎng)發(fā)根 , 從發(fā)根中提取紫杉醇。由于 發(fā)根速度較快 , 且遺傳性狀穩(wěn)定 , 有望成為工業(yè)化生產紫杉醇的一條新途徑。四、進行紫杉醇的細胞培養(yǎng)自1989年首次利用細胞培養(yǎng)技術生產紫杉醇后 , 紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的研究 報告呈逐年增加趨勢 , 研究范圍涉及細胞株系的選擇 , 細胞生長、紫杉醇生產及 營養(yǎng)成分消耗的動力學、誘導物、菌體、激素的種類和濃度、糖的種類和濃度、 生物過程的偶合、生物反應器的種類、培養(yǎng)環(huán)境等方面的內容。目前利用細胞培 養(yǎng)技術生產紫杉醇的研究已經進入到生物反應器放大階段。五、進行紫杉醇產生菌的工程菌株構建與發(fā)酵生產利用生物技術合成紫杉醇是近年來國內外的研究熱點。其中微生物生產紫杉 醇的研究取得了突破性進展 , 但就目前水平來說 , 還達不到工業(yè)化生產的要求。 微生物發(fā)酵法生產紫杉醇的關鍵問題是紫杉醇產生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇 產量的提高 , 這也是構建工程菌株的關鍵 , 目前還有許多關鍵技術問題需要解 決。研究者認為有兩個設想是可行的 : 其一是從紅豆杉中分離紫杉醇基因組