興奮藥的LD50測(cè)定(共9頁(yè))

1、 中樞藥物篩選與興奮(xngfn)藥LD50測(cè)定的設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 學(xué)院(xuyun)： 藥科學(xué)院 【摘要(zhiyo)】目的：了解中樞興奮(xngfn)藥的藥效及臨床表現(xiàn)，從三種未知的藥物鑒別與篩選出目標(biāo)藥物中樞興奮藥，進(jìn)行(jnxng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)前預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察中樞興奮藥對(duì)小鼠的毒性反應(yīng)，確定中樞興奮藥的LD50。方法：通過(guò)查書籍文獻(xiàn)確定小鼠對(duì)中樞興奮藥和抑制藥的一般反應(yīng)，通過(guò)腹腔注射三種未知藥物篩選出目標(biāo)藥物。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)出中樞興奮藥的LD0為187.5mg/kg，和LD100為375mg/kg，按照1:0.84的組距設(shè)5組，通過(guò)LD50數(shù)據(jù)處理軟件用Bliss法測(cè)定中樞興奮藥的LD50，同

2、時(shí)觀察記錄各組小鼠的毒性反應(yīng)。結(jié)果：目標(biāo)藥物的LD50為227.3mg/kg,95%可信限為145.1356.1mg/kg，該藥對(duì)小鼠產(chǎn)生的一般毒性反應(yīng)為撓臉，豎尾，增加劑量是跳躍，口吐白沫，抽搐的毒性反應(yīng)發(fā)生率有所增加。結(jié)論：7號(hào)藥為生理鹽水，8號(hào)藥為中樞興奮藥，9號(hào)藥為中樞抑制藥。該中樞興奮藥的LD50為227.3mg/kg。 前言(qin yn)目前作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物種類很多， 如抗焦慮藥、抗抑郁藥、催眠藥、抗震顫麻痹藥和抗精神失常藥等。 作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物主要影響遞質(zhì)和受體，中樞神經(jīng)系統(tǒng)不但神經(jīng)遞質(zhì)種類較多，而且神經(jīng)激素及神經(jīng)調(diào)質(zhì)也起到重要作用。這類藥物用藥時(shí)間長(zhǎng)，副作用出

3、現(xiàn)(chxin)頻率高，有可能出現(xiàn)不可逆的后遺癥；有的藥物過(guò)量服用，還可能引起死亡，對(duì)此必須高度重視。另外，對(duì)制藥行業(yè)來(lái)說(shuō)，年銷售規(guī)模達(dá)到 650 億美元的作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）藥物或許是最具挑戰(zhàn)性，同時(shí)又是回報(bào)最豐厚的市場(chǎng)之一。專業(yè)人士分析，抑郁是最常見的精神疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有 1.2 億人罹患此病，世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測(cè)，到 2020 年，抑郁癥將成為人們失去生活能力的一個(gè)主要原因。在 CNS 藥物市場(chǎng)中最大一部分 是抑郁癥藥物市場(chǎng)?？焖僭龅?CNS 藥物市場(chǎng)中，仍有許多尚未得到滿足的臨 床需求以及新的治療方法，對(duì)那些已經(jīng)積極介入或正在考慮介入該市場(chǎng)的制藥公司來(lái)說(shuō)，CNS 藥

4、 物市場(chǎng)無(wú)疑是一塊極具吸引力的”蛋糕(dngo)” .由于中樞興奮藥有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物的研究很有必要。 其中，中樞興奮藥是能提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能活動(dòng)的一類藥物，藥物的藥理毒理評(píng)價(jià)是藥物臨床前期的必要內(nèi)容，其常用的方法便是測(cè)定其半數(shù)死量（Lethal dose 50%,LD50）,它是衡量藥物毒性大小的指標(biāo)，評(píng)價(jià)藥物安全性和藥物優(yōu)劣的重要參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)就是對(duì)未知中樞興奮藥的LD50進(jìn)行測(cè)定及觀察其引起的毒性反應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】 興奮藥 LD50 毒性 Bliss法 1. 實(shí)驗(yàn)(shyn)目的 學(xué)習(xí)如何篩選有效的藥物，通過(guò)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)(shyn)鍛煉和提高科學(xué)研究的思維方式、藥理學(xué)實(shí)

5、驗(yàn)設(shè)計(jì)原則和方案。最終達(dá)到提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、提出(t ch)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題能力，提高學(xué)生的自學(xué)能力、實(shí)踐能力和團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和創(chuàng)新能力。 2.實(shí)驗(yàn)器材 2.1. 器材 鼠籠，電子天平，注射器，針頭，小燒杯2.2. 藥品 中樞性藥物，生理鹽水，蒸餾水2.3. 動(dòng)物 體重1822g健康小鼠68只，雌雄各半（雌鼠應(yīng)無(wú)孕），（預(yù)實(shí)驗(yàn)18只，正式實(shí)驗(yàn)50只） 3.實(shí)驗(yàn)(shyn)方法3.1. 預(yù)實(shí)驗(yàn)(shyn)3.1.1. 中樞藥物(yow)的鑒別與篩選3.1.1.1.隨機(jī)捉取3只小鼠，腹腔注射未知三種藥物，分別根據(jù)小鼠的反應(yīng)對(duì)待測(cè)的3種藥物作出鑒別和篩選，并從中找出目標(biāo)藥物

6、中樞興奮藥進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3.1.2. 藥物L(fēng)D0及LD100測(cè)定3.1.2.1. 捉取15只小鼠，隨機(jī)分成5組，每組3只，然后稱重，編號(hào)，記錄數(shù)據(jù)。3.1.2.2.以中樞興奮藥的臨床表現(xiàn)，分別對(duì)原藥進(jìn)行一定濃度的稀釋混勻（本組隊(duì)原藥稀釋的比例為1/2,1/4,1/5,1/6,1/8）, 后分別對(duì)每組小鼠腹腔注射稀釋藥劑（0.2ml/10g），觀察每組小鼠的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。3.1.2.3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)出受測(cè)藥的LD0和LD100。3.2. 正式實(shí)驗(yàn)3.2.1.實(shí)驗(yàn)分組 抽取50只小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，盡可能使小鼠的體重相對(duì)均勻，后分別對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記稱重，記錄數(shù)據(jù)。3.2

7、.2.藥物劑量計(jì)算及藥液配制3.2.2.1.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果找出DMIN,DMAX，設(shè)正式實(shí)驗(yàn)劑量組數(shù)為n，劑量公式比r，則r=（Dmin/Dmax)(1/(n-1) 各組劑量為Dmax*r(k-1),k為第幾組，一般選用47組動(dòng)物，r為0.60.85為宜。我組測(cè)得經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得最小劑量（Dmin）：187.5mg/kg,最大劑量（Dmax）：375mg/kg。當(dāng)n=5時(shí)，r=0.841.375mg/kg2.375mg/kg*0.84=315mg/kg;3.375mg/kg*0.842=264.62mg/kg;4.375mg/kg*0.843=222.26mg/kg;5.375mg/kg*0.84

8、4=186.70mg/kg 3.2.2.2.藥液配制 藥源緊張時(shí)的配藥方法各組所需母液的體積（ml）為：第一組 1.5 第三組1.26 第五組 1.06第四組 0.89 第五組 0.75 母液總體積（V）=10*（1+0.84+0.842+0.843+0.844+0.845)總藥量（M)=母液總體積x*Dmax /(20ml/kg)各劑量組藥液按下法稀釋：用移液管精密量取1.5ml，用蒸餾水稀釋至6ml，為一組藥液用移液管精密量取1.26ml，用蒸餾水稀釋至6ml，為二組藥液用移液管精密量取1.06ml，用蒸餾水稀釋至6ml，為三組藥液用移液管精密量取0.89ml，用蒸餾水稀釋至6ml，為四組

9、藥液5.用移液管精密量取0.75ml，用蒸餾水稀釋至6ml，為五組藥液3.2.3.給藥 對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹腔注射相應(yīng)濃度的藥液（0.2ml/10g），觀察并記錄給藥后2小時(shí)內(nèi)小鼠的反應(yīng)情況(qngkung)（是否死亡），最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并按照Bliss法計(jì)算LD50值及其95%可信限。 4.實(shí)驗(yàn)(shyn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理4.1.預(yù)實(shí)驗(yàn)(shyn) 表1. 鑒別藥物實(shí)驗(yàn)情況組別 編號(hào) 小鼠反應(yīng) 藥物17無(wú)特別反應(yīng)生理鹽水28直立、呼吸急促、亂竄、咬舌、死亡興奮藥39抽搐、死亡抑制藥 表2 . LD0和LD100的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)情況小組(每組3只)注射劑量（mg/kg)小鼠反應(yīng)死亡率1750亂竄、跳動(dòng)、

10、咬舌、3只小鼠均死亡100%2375亂竄、跳動(dòng)、咬舌、3只小鼠死亡10%3300亂竄、跳動(dòng)、有一只小鼠死亡33.3%4250亂竄、跳動(dòng)、有1只老鼠死亡33.3%5187.5小鼠給藥前后無(wú)特殊反應(yīng)0% 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，可推測(cè)該興奮藥物的LD0LD100的范圍為187.5mg/kg375mg/kg。 4.2.正式(zhngsh)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)結(jié)果(ji gu)】結(jié)果記錄于下表 表3.小鼠對(duì)不同劑量(jling)興奮藥的反應(yīng)分組 注射劑量 小鼠反應(yīng) 死亡率 （mg/kg）1375亂竄、跳動(dòng)、咬舌、10只小鼠均死亡100%2315亂竄、跳動(dòng)、咬舌、有9只小鼠均死亡90%3264.6亂竄、跳動(dòng)、咬舌、有6只

11、小鼠均死亡60%4222.3亂竄、跳動(dòng)、有1只小鼠均死亡10%5187.5亂竄、跳動(dòng)、有1只小鼠均死亡10%按Bliss法計(jì)算LD50和95%可信限。Bliss法計(jì)算較為繁瑣，先多采用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行計(jì)算。 表格 4.中樞神經(jīng)興奮藥對(duì)小鼠LD50測(cè)定數(shù)據(jù)組別劑量（mg/kg)對(duì)數(shù)劑量（x）動(dòng)物只數(shù)死亡動(dòng)物數(shù)死亡率（%）幾率單位（Y)1375mg/kg2.5741010100%33.0002315mg/kg2.49810990%6.2803264.62mg/kg2.42310660%5.2504222.26mg/kg2.34710110%3.7205186.7mg/kg2.27310110%3.7

12、20按Bliss法計(jì)算LD50和95%可信限。Bliss法計(jì)算較為繁瑣，先多采用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行計(jì)算?；貧w線方程為：Y=-186.5959+81.3009X,(r=0.7636)a=0.01時(shí)，查得的r為：0.9590所以LD50=227.3151750mg/kg置信(zhxn)系數(shù)a=0.05時(shí)的置信區(qū)間為：145.0914LD50356.1346，0.1950 5討論(toln)5.1.實(shí)驗(yàn)(shyn)注意事項(xiàng) 動(dòng)物分組要做到隨機(jī)性 實(shí)驗(yàn)中能控制的因素盡量使之均衡化，難以控制得因素也應(yīng)力求嚴(yán)格隨機(jī)化。分組時(shí)應(yīng)先將不同性別分開，再將不同體重分開，然后隨機(jī)分配，此法稱為分層隨機(jī)分組法。 給藥途徑

13、的選擇 藥物及給藥途徑應(yīng)以靜脈注射、腹腔注射和灌胃給藥為主，選取的途徑必須包括推薦臨床給藥途徑。LD50測(cè)定方法有很多，較常用的有寇氏法（Karber法）、加權(quán)幾率單位發(fā)（Bliss法）、目測(cè)幾率單位法、綜合法、序貫法等。其中Bliss法被認(rèn)為是目前最經(jīng)典、最精確的方法，受到我國(guó)新藥臨床前毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則的推薦，計(jì)算相當(dāng)復(fù)雜，現(xiàn)可用計(jì)算機(jī)和相應(yīng)軟件來(lái)完成，可化繁為簡(jiǎn)。5.2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，我們首先要做的就是了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的特點(diǎn)。作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物從作用機(jī)制上來(lái)看， 絕大多數(shù)藥物的作用方式是通過(guò)影響突觸化學(xué)傳遞的某一環(huán)節(jié)（如影響遞質(zhì)的生成

14、、貯存、釋放和滅活的過(guò)程；激動(dòng)或阻斷受體）而產(chǎn)生藥理效應(yīng)； 尚有少數(shù)藥物是通過(guò)一般地影響神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝或膜穩(wěn)定性而產(chǎn)生作用。 作用于中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的藥物產(chǎn)生中樞興奮效應(yīng)時(shí)的表現(xiàn)為欣快、失眠、不安、幻覺、妄想、躁狂、驚厥等；出現(xiàn)中樞抑制效應(yīng)時(shí)則表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜、抑郁、睡眠、昏迷等。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察三組試樣藥物注射完后小鼠的表現(xiàn)，第一只小鼠沒(méi)出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象。第二只小鼠變得很暴躁，上下跳動(dòng)，異?；顫姡粑涌?，最后死亡。第三只小小鼠變得安靜嗜睡，呼吸微弱，10min 后死亡。由此推斷三種藥物分別是生理鹽水，興奮藥，抑制藥。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，給藥濃度較高的小鼠死亡的速度和數(shù)量都比用藥濃度低的小鼠快和多，說(shuō)明

15、小鼠是否死亡和用藥濃度在一定區(qū)間內(nèi)呈正相關(guān)。 我們都知道，藥物劑量是影響藥物效應(yīng)的重要因素。不同的劑量可以激活劑量相關(guān)靶點(diǎn),所以同一種藥物的多種作用及其不良反應(yīng)與劑量有著密切的關(guān)系。藥物劑量與藥物發(fā)現(xiàn)存在著相互聯(lián)系。 一種藥物在使用過(guò)程中,由于劑量的不同,會(huì)出現(xiàn)新的藥物效應(yīng),有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn),加快藥物發(fā)現(xiàn)的速度。藥物發(fā)現(xiàn)的研究方法,尤其是涉及藥物安全性評(píng)價(jià)方法,將直接影響藥物劑量的確定。 . 5.3.實(shí)驗(yàn)體會(huì)與心得 .這是我們第一次做自主設(shè)計(jì)性藥物實(shí)驗(yàn)方案，在這次藥理學(xué)的中樞性藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)查找閱讀大量的文獻(xiàn)，獨(dú)立思考，小組討論的方式來(lái)設(shè)計(jì)并完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)的。鍛煉了我的綜合實(shí)驗(yàn)技能，很大程度上提 高了我的動(dòng)手能力和思考能力。 . 本次實(shí)驗(yàn)中有效地培養(yǎng)和提高了我們的團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力，同時(shí)也使自身的責(zé)任感得到加強(qiáng)。 . . 6.結(jié)論 、預(yù)實(shí)驗(yàn)：7號(hào)藥為生理鹽水，8號(hào)藥為中樞興奮藥，9號(hào)藥為抑制劑。測(cè)出我們組興奮藥能引起的最大劑 量375 mgkg，最小劑量(jling)187.5mgkg。正式(zhngsh)實(shí)