槲皮素與人血清白蛋白作用機理

1、槲皮素與人血清白蛋白作用機理王歡，王姣，蒲小華，李宗孝（ 陜西省植物化學(xué)重點實驗室，陜西寶雞 721013）摘 要: 采用熒光光譜、紫外吸收光譜、分子模擬等技術(shù)，研究了槲皮素與人血清白蛋白(HSA)相互作用的熱力學(xué)行為。熒光實驗結(jié)果表明：槲皮素與HSA相互作用時，隨著槲皮素的濃度從0增加到19.6210-7 mol/L，HAS的熒光強度從844.3下降到461.4，最大發(fā)射波長由340.7 nm降低到338.6 nm，變化不明顯，并且隨著溫度從298K升高到303K，猝滅常數(shù)由4.66 105 L/mol減小到2.69 105 L/mol，說明槲皮素對HSA的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，猝滅機理

2、為靜態(tài)猝滅。分子模擬結(jié)果顯示：槲皮素分子在HAS 的Sudlow I位點和Sudlow II位點的結(jié)合最高積分別為6.41和7.36，總能量分別為 -37.01 kJ/mol和-39.98 kJ/mol，表明其在Sudlow II位點的結(jié)合能力較強，且兩種結(jié)合的作用力主要為氫鍵作用（鍵能分別為- 10.41 kJ/mol和-12.34 kJ/mol）。在位點I和位點II上，槲皮素分子與發(fā)光氨基酸殘基Trp214的質(zhì)心距離分別為1.36和2.40 nm。這與根據(jù)Frsters非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算的平均距離3.04 nm結(jié)果基本吻合。關(guān)鍵詞：人血清白蛋白；熒光光譜；分子模擬技術(shù)；槲皮素；靜態(tài)猝滅

3、中圖分類號：O657.3 文獻標識碼：A Study on the Mechanism between Quercetin and Human serum albuminWANG Huan, WANG Jiao, PU Xiao-hua, LI Zong-xiao*(Shannxi Key Laboratory of Phytochemistry,Baoji, Shaanxi 721013, China)Abstract: The thermodynamic behavior of the interaction between Quercetin and HSA is investigate

4、d by FS, UVS and MS. In fluorescence experiments, The interaction of quercetin and HSA, with C (quercetin) increased from 0 to 19.6210-7 mol/L, the fluorescence intensity of HAS decreased from 844.3 to 461.4, the maximum emission wavelength from 340.7 nm to 338.6 nm, did not change significantly, an

5、d as the temperature increases from 298K to 303K, the quenching constant decreases from 4.66105 L/mol to 2.69105 L/mol the fluorescence intensity of HSA obviously decreases with the increase of quercetin concentration, but the maximum emission wavelength has no obvious displacement, and the quenchin

6、g constant decreases with the raising of temperature. The results show that quercetin can strongly quench intrinsic fluorescence of HSA and quenching mechanism of quercetin with HSA is mainly a static quenching. In molecular simulation experiments, the quercetin molecule on Sudlows sites I and Sudlo

7、ws sites II with the highest point are 6.41 and 7.36, in a total energy of -37.01 kJ/mol and -39.98 kJ/mol respectively, show stronger binding on site II and hydrogen bonding interactions are the major forces(bond energies are -10.41 kJ/mol and -12.34 kJ/mol respectively). And on the site I and site

8、 II, the distances from quercetin to the center position of fluorescent amino acid residues Trp214 are 1.36 and 2.40 nm, which are in agreement with the distance (3.04 nm) of calculated by the Frsters non-radiative energy transfer theory.Key words: HSA; fluorescence; molecular simulation; Quercetin;

9、 static quenchingFoundation items: the Key Laboratory of Shannxi Province(12JS006); Education Department of Shaanxi Provincial Government (14JK1045).基金項目： 陜西省重點實驗室項目 (12JS006)；陜西省教育廳項目(14JK1045)作者簡介：王歡（1991.11），男，碩士研究生，碩士學(xué)位。聯(lián)系人：李宗孝，教授，電話E-mail: 近年來，國內(nèi)外對天然藥物槲皮素的生理活性進行了大量研究，結(jié)果表明：槲皮素是一種生理及

10、藥理活性顯著的多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果與油中。結(jié)構(gòu)相對簡單，具有止咳、祛痰、抗炎、抗過敏、抗菌、抗氧化和心血管保護作用，可用作食用黃色素和天然染料，能夠降低血脂、增加冠狀動脈血流量，對治療冠心病和高血壓具有輔助作用，并對惡性腫瘤的治療和預(yù)防具有明顯作用1-5。大量研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對諸如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等具有良好的治療效果，并對艾氏腹水癌細胞DNA轉(zhuǎn)錄與翻譯、RNA的表達和蛋白激酶的活性具有明顯的抑制，以此抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，促進癌細胞的凋亡6。藥物進入生物體內(nèi)，需要通過血液進行運輸并轉(zhuǎn)運至病灶部位。人血清白蛋白(Human Serum Albumin， HSA)含有3

11、5個半胱氨酸，其中34個形成了17個二硫鍵，這些二硫鍵的存在固定了肽鏈的相對位置，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，對HSA 發(fā)揮正常的生理功能有著重要的作用6，它由585個氨基酸殘基組成，主要由多個-螺旋構(gòu)成，兼具結(jié)合和運輸很多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的作用7-13。在維持生物體血液酸堿平衡、催化藥物活性、清除自由基、抗凝作用、酶活性、酶抑制劑活性、運輸內(nèi)源性（如膽紅素及脂肪酸）和外源性（如藥物和外源性化學(xué)物質(zhì)）物質(zhì)等方面發(fā)揮了重要作用14-15。申炳俊16等，在模擬生理條時發(fā)現(xiàn)，香豆酸（p-CA）與人血清白蛋白（HSA）的結(jié)合機制為靜態(tài)猝滅，并伴有非輻射能量轉(zhuǎn)移，二者之結(jié)合主要為靜電引力；黃漢昌17等采用紫

12、外法研究了蘆丁與（HSA）結(jié)合方式，發(fā)現(xiàn)（HSA）引起了蘆丁紫外可見光譜波峰紅移，但并未引起（HSA）二級結(jié)構(gòu)改變；朱美霖18等研究了不同溫度下沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與（HSA）的相互作用，得到了靜態(tài)猝滅常數(shù)及結(jié)合常數(shù)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)合為自由能降低的自發(fā)過程。而研究槲皮素分子與人血清白蛋白（HSA）的結(jié)合，將是藥物動力學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容。它有助于從分子水平深入了解其發(fā)揮藥效活性的途徑和作用，對闡述槲皮素在生物體內(nèi)的輸送和代謝，對受體釋放，避免藥物迅速代謝，對其毒理學(xué)、安全風(fēng)險及了解槲皮素分子在人體內(nèi)的評估具有較高的借鑒意義。1、實驗部分1.1試劑與儀器槲皮素（質(zhì)量分數(shù)98 %）為方晟

13、生物開發(fā)有限公司；人血清白蛋白（質(zhì)量分數(shù)為99 %）、三羥甲基氨基甲烷等均為Sigma公司產(chǎn)品；實驗用水為超純水（18.2 M/cm，25 oC）。RF-5301 PC熒光光度計、UV-2550紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司； Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。1.2實驗方法1.2.1溶液配置HSA等溶液均用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制，所有溶液于冰箱中4 oC避光保存。1.2.2熒光光譜設(shè)定激發(fā)波長ex=280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度都為5 nm，測得體系pH=7.4時的熒光光譜。模擬人體環(huán)境，固定HSA濃度（1.

14、4510-6 mol/L），逐步增加槲皮素濃度依次為0 、2.2010-7、4.3910-7、6.5810-7、8.7610-7、1.09510-6、1.31210-6、1.52910-6、1.74610-6、1.96210-6 mol/L，分別記錄溫度在293、298、303 K下的熒光發(fā)射光譜。1.2.3紫外吸收光譜273K下，以Tris-HCl緩沖液為參比，濃度為1.4510-6 mol/L的槲皮素溶液為樣品，測定波長在200350 nm范圍內(nèi)槲皮素溶液的吸收光譜。1.2.4分子模擬技術(shù)人血清白蛋白(HSA)的晶體結(jié)構(gòu)由RSCB Protein Data Bank獲得，使用Sybyl 8

15、.1軟件中的Biopolymer Prepare Suite程序?qū)SA的晶體結(jié)構(gòu)進行分析準備，移除晶體水分子以及小分子配體，添加氫鍵取向的氫原子，計算并添加AMBER7FF99電荷。與梣酮分子的分子對接由suflex dock軟件完成。對接結(jié)果通過vmd軟件進行分析。2結(jié)果與討論2.1熒光猝滅機理及猝滅常數(shù)依據(jù)1.2.1方法，得到熒光結(jié)果圖1，其中aj分別表示槲皮素的濃度分別為0 、2.2010-7、4.3910-7、6.5810-7、8.7610-7、1.09510-6、1.31210-6、1.52910-6、1.74610-6、1.96210-6 mol/L。圖1 加入不同濃度槲皮素后H

16、SA的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of HSA (1.4510-6 mol/L) with presence of various concentrations of Quercetin.; 由圖1可知，HSA在338 nm（ex= 280 nm）有熒光現(xiàn)象產(chǎn)生，主要是因為在HSA亞域IIA中存在Trp214。藥物與HSA相互作用，導(dǎo)致其內(nèi)源熒光強度的下降，即表現(xiàn)出熒光猝滅現(xiàn)象。圖1中，熒光強度隨著槲皮素濃度的增加而明顯下降，但其最大發(fā)射波長位置并沒有明顯的移動，這表明槲皮素可以有效地猝滅HSA的內(nèi)源熒光19。采用Stern-Volmer方程，計算不同溫度下槲

17、皮素對HSA 的猝滅常數(shù)： (1)式中，F(xiàn)0和F為非存在和存在猝滅劑時的熒光強度；Q為猝滅劑的濃度（mol/L），Ksv即Stern-Volmer猝滅常數(shù)（L/mol），；Kq為表觀雙分子猝滅的速率常數(shù)L/（mols）；0表示不存在猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命5.71 10-9 s。對動態(tài)猝滅，受碰撞幾率的限制，不同種類猝滅劑的最大碰撞猝滅速率常數(shù)通常不大于2.01010 (L/mols）20。按(1)式計算結(jié)果見圖2及表1。圖2 不同溫度下藥物槲皮素與HSA作用的Stern-Volmer關(guān)系圖Fig.2 Stern-Volmer plots for the interaction of

18、Quercetin and HSA at different temperatures表1不同溫度下藥物槲皮素對HSA作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Ksv and Kq of Quercetin and HSA interaction system at different temperaturesT/KKsv/(L/mol)Kq（L/mols)R22934.66 1058.16 10130.99782984.17 1057.30 10130.99883032.69 1054.71 10130.9991一般而言， Ksv隨溫度上升而減小為靜態(tài)猝滅；與此相反， Ksv隨溫

19、度升高而增大為動態(tài)猝滅。由圖2可知在pH = 7.4 時，在溫度分別為293、298、303K時，所對應(yīng)的直線斜率即猝滅常數(shù)隨溫度的升高呈降低趨勢，隨著溫度的升高猝滅常數(shù)減小，且Kq遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)（2.01010 L/mol/s），表明槲皮素對HSA的熒光猝滅機理為靜態(tài)猝滅，這是兩者之間形成無熒光配合物的緣故。2.2熱力學(xué)參數(shù)與作用力類型為了進一步確定不同溫度下槲皮素對HSA作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)，對靜態(tài)猝滅過程，可用修正的Stern-Volmer方程對其熒光猝滅數(shù)據(jù)進行處理： （2）以對作圖，即可求得HSA與藥物槲皮素的結(jié)合常數(shù)Ka。利用Vant Hoff 方程，可計算反

20、應(yīng)的焓變H 和熵變S： (3)式中K 為對應(yīng)該溫度下的結(jié)合常數(shù)；R 為摩爾氣體常數(shù)。根據(jù)計算出焓變H和熵變S，可計算出槲皮素與HSA反應(yīng)的吉布斯自由能變化： (4)根據(jù)方程（2）、（3）和（4）計算所得的熱力學(xué)函數(shù)，列于表2中。表2 不同溫度下藥物槲皮素對HSA作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)函數(shù)Table 2 Binding constants and thermodynamic function of Quercetin-HSA system at different temperatureT/KnKa/(L/ mol)H/(kJ/mol)G/(kJ/mol)S/(J/molK)2930.941.4

21、2 106-81.49-34.52159.412980.861.08 106-34.433031.130.47 106-32.92由表2可看出，槲皮素與HSA結(jié)合過程的H 0,說明系統(tǒng)的無序度增大，有利于反應(yīng)進行；計算得到的G0，所有結(jié)果顯示該過程是一個熵焓協(xié)同驅(qū)動的自發(fā)過程。這個反應(yīng)中所產(chǎn)生的熵變，有可能是微環(huán)境的改變和蛋白質(zhì)部分氨基酸殘基去溶劑化造成的21-22。圖3為不同溫度下藥物槲皮素與HSA作用的修正Stern-Volmer曲線圖3 不同溫度下藥物槲皮素與HSA作用的修正Stern-Volmer曲線Fig.3 Modified Stern-Volmer of Quercetin an

22、d HSA at different temperature由圖3可以看出，當溫度分別為293、298、303K時，溫度越高，HSA與藥物槲皮素的結(jié)合常數(shù)Ka越小。2.3 能量轉(zhuǎn)移與結(jié)合距離Forster非能量轉(zhuǎn)移理論通常被用來估計配體與蛋白質(zhì)色氨酸部分的距離。根據(jù)Frsters非能量轉(zhuǎn)移理論，供體和受體之間的能量轉(zhuǎn)移效率(E)可用以下公式(5)計算： (5)圖4是HSA與槲皮素的熒光光譜和吸收光譜重疊圖 圖4 HSA與槲皮素的熒光光譜和吸收光譜重疊圖Fig .4 Spectral overlap of the absorption spetra of Quercetin with the f

23、luorescence spectra of HSA,c(HSA)=c(Quercetin)= 1.4510-6 mol/L. 式中，F(xiàn)0和F代表非存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度；r 表示受體與供體之間的平均距離；R0表示能量轉(zhuǎn)移效率是50 %時的供體與受體之間的臨界距離。R0可通過如下的方程來計算： (6)K2指的是供體-受體偶極的空間取向因子，取平均值2/3；n為介質(zhì)折射常數(shù)，取1.336；為供體的熒光量子產(chǎn)率，按照0.15計算；J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分，可由下式求出： (7)F()為熒光給體在波長處的熒光強度，()為受體在波長處的摩爾吸光系數(shù)。J 值可根據(jù)方程7

24、通過圖5中的重疊光譜計算。通過以上三個方程的計算，可得到：Quercetin -HSA（1:1），J = 1.92 10-14 cm3L/mol，R0 =2.81nm，E=0.386，r= 3.04 nm； r值在28 nm 之間，而且符合0.5R0 r 1.5R0，說明非輻射能量轉(zhuǎn)移確實可在HSA與槲皮素之間發(fā)生，并且非常符合Frsters非輻射能量轉(zhuǎn)移理論的預(yù)測23。2.4 分子模擬采用1.2.4分子對接方法進行槲皮素和HSA的對接計算，結(jié)果如圖5所示：確定為彩圖圖 5槲皮素對HSA的三維結(jié)構(gòu)分子對接Fig.5 Molecular docking of Quercetin on the t

25、hree-dimensional structure of HSA. (Panel of a and c show the residues of HSA interacting with Quercetin at subdomain IIA and subdomain IIIA. Panel b and d show the residues of HSA interactions)槲皮素分子在位點I和位點II的結(jié)合最高積分分別為6.41和7.36，總能量分別為 -37.01kJ/mol和-39.98 kJ/mol，表明在位點II的結(jié)合更強，槲皮素與蛋白之間存在強的極性作用。如圖5所示，Si

26、te I: 結(jié)合位點5以內(nèi)的氨基酸殘基包括GLU153，PHE156，PHE157，ARG160，GLU188，ALA191，LYS195，LYS199，HIS288，GLU292，ASP451。槲皮素的羥基與GLU153，GLU88，ASP451形成氫鍵，環(huán)上的氧原子與LYS195的側(cè)鏈形成氫鍵，能量為-10.41 kJ/mol。Site II:槲皮素結(jié)合在螺旋形成的空腔當中，發(fā)現(xiàn)周圍的氨基酸殘基包括：LEU387，ASN391，ARG410，LYS414，LEU453，ARG485，SER489，PHE488，LEU491，GLU492。槲皮素分子的羥基與ASN391和GLU492的極性側(cè)

27、鏈形成氫鍵，與ARG485和LEU491主鏈上的氧原子形成氫鍵，能量為 -12.34 kJ/mol。在位點I和位點II槲皮素分子與發(fā)光氨基酸殘基Trp214的質(zhì)心距離分別為1.36和2.40 nm。槲皮素作為抗癌藥物，一般都要經(jīng)過一個血漿儲存和運輸?shù)倪^程才能達到受體部位發(fā)揮生理功能，其與HSA以較低的結(jié)合能發(fā)生作用，這種結(jié)合的主要作用力是氫鍵作用，不需外界供給特殊能量，并且藥效受到與HSA 結(jié)合作用的影響。顯然，可依據(jù)此特性從結(jié)構(gòu)修飾，或是借助其他物理手段保護入手，來提高藥物在臨床應(yīng)用中的安全性和高效性，并且研究藥物與HSA 相互作用模式，對新藥發(fā)現(xiàn)和藥理學(xué)來說，是非常重要和緊迫的。3、結(jié)論槲

28、皮素與HSA相互作用時以氫鍵作用為主導(dǎo)，同時槲皮素對HSA的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，猝滅機理為靜態(tài)猝滅。分子模擬顯示，槲皮素在HAS的位點I和位點II上，與發(fā)光氨基酸殘基Trp214的質(zhì)心距離分別為1.36 nm和2.40 nm。這些結(jié)果對初步闡明了槲皮素與HSA的結(jié)合機制，為進一步研究槲皮素與HSA奠定了基礎(chǔ)。特別是分子模擬技術(shù)的使用，對揭示人血清白蛋白與藥物作用將產(chǎn)生重要意義。參考文獻1 Zhao L, Wu J, Wang Y, et al. Cholesterol metabolism is modulated by quercetin in ratsJ.Journal of agr

29、icultural and food chemistry,2011,59(4) :1104-1108.2 Du Chuanrong(杜傳榮), Lu Dongwei(逯東偉)，Shi Kang(石康), et al. Synthesis of Three Cinnamamide Derivatives and Their Interaction Mechanism with Human Serum AlbuminJ. Chinese Journal of Luminescence(發(fā)光學(xué)報), 2015, 36(11) : 1342-1352.3 Lu Congwen(陸從文),Lan Xiu

30、feng(蘭秀風(fēng)),Zhang Lin(張林), et al.Interaction between Ebastine and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopyJ.Acta Photonica Sinica(光子學(xué)報),2015,44(10) :1030004-1-1030004-6.4 Precupas A, Sandu, Popa V T. Quercetin Influence on Thermal Denaturation of Bovine Serum AlbuminJ.The Journal of Physical

31、Chemistry B,2016, 120(35) :9362-9375.5 Kato K, Ninomiya M, Tanaka K, et al. Effects of Functional Groups and Sugar Composition of Quercetin Derivatives on Their Radical Scavenging PropertiesJ.Journal of Natural Products,2016, 79(7) :1808-1814.6 Han X L，Tian F F , Ge Y S, et al. Spectroscopic, struct

32、ural and thermodynamic properties of chlorpyrifos bound to serumalbumin: A comparative study between BSA and HSAJ. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology; 2012, 109 : 1-11.7 Zhang Y Z , Li H R, Dai J, et al. Spectroscopic Studies on the Binding of Cobalt(II) 1,10-Phenanthroline Complex

33、 to Bovine Serum AlbuminJ.Biological Trace Element Research, 2010, 135: 136-152.8 Wang Huan(王歡)，Wang Jiao(王姣)，Li Zongxiao(李宗孝), et al. Interaction Dynamics Between Dacarbazine and DNAJ. Chinese Journal of Luminescence(發(fā)光學(xué)報), 2016,37(12) : 1560-1565.9 Peyrin E, Guillaume Y C, Guinchard C. HSA-solute

34、interactions, enantioselectivity, and binding site geometrical characteristicsJ. Analytical chemistry,1998, 70(20):4235-4240.10 Lai L, Lin C, Xu Z Q, et al. Spectroscopic studies on the interactions between Cd Te quantum dots coated with different ligands and human serum albuminJ. Spectrochimica Act

35、a Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2012, 97 :366-37611 Sabin J, Prieto G, Ruso J M, et al. Interactions between DMPC liposomes and the serum blood proteins HSA and IgGJ.The Journal of Physical Chemistry B, 2009,113(6) :1655-1661.12 Sen T, Mandal S, Haldar S, et al. Interaction of gol

36、d nanoparticle with human serum albumin (HSA) protein using surface energy transferJ.The Journal of Physical Chemistry C,2011,115(49) :24037-24044.13 Martin C, Cohen B, Gaamoussi I, et al. UltrafastDynamics of C30 in Solution and within CDs and HSA ProteinJ.The Journal of Physical Chemistry B,2014,1

37、18(21) : 5760-5771.14 Ji Y, Li T, Song Y F. Adsorption of human serum albumin (HSA) by SWNTs/Py-PW11nanocompositeJ.Industrial & Engineering Chemistry Research, 2014,53(28) : 11566-11570.15 Lucas L H, Price K E, Larive C K. Epitope mapping and competitive binding of HSA drug site II ligands by NMR di

38、ffusion measurementsJ.Journal of the American Chemical Society, 2004,126(43) ;14258-14266.16 Zhu Meilin(朱美霖), Lu Jie(陸潔), Han Mei(韓梅). Interaction of Epigallocatechin Gallate with Human Serum Albumin J. Journal of Beijing Normal University （Natural Science）(北京師范大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版), 2011, 47(3) : 277-280.17 Huang Hanchang(黃漢昌), Jiang Zhaofeng(姜招峰). The UV- Vis Spectrum Analysis on the Interaction between Rutin and Hu