土壤中纖維素分解菌分離

1、關(guān)于土壤中纖維素分解菌的分離第一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、課題目標(biāo) 簡述纖維素酶的種類及作用，從土壤中分離出分解纖維素的微生物，討論這類微生物的應(yīng)用價值。 二、課題重點與難點 從土壤中分離分解纖維素的微生物。 （1）纖維素酶分解纖維素生化原理 （2）區(qū)別選擇培養(yǎng)與鑒別培養(yǎng)概念 （3）比較纖維素粉培養(yǎng)法與剛果紅染色法原理 第二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、基礎(chǔ)知識 （一） 纖維素與纖維素酶1.纖維素在生物圈的分布； 人類以淀粉為主要能量來源，但完全不能消化纖維素，而反芻動物和大量的微生物則主要以纖維素為能量來源。這是因為，在反芻動物的瘤胃中生活著大量的可以分解

2、纖維素的微生物。 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì).植物的根莖葉等器官都含有大量的維生素.地球上的植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸.第三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.纖維素酶的結(jié)構(gòu)和作用原理 纖維素與淀粉都是由葡萄糖組成的，但組成兩者的葡萄糖的連接方式不同，因而使兩者的形態(tài)完全不同。纖維素是由葡萄糖分子按-1,4糖苷鍵連接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按-1,4糖苷鍵連接而成的。 纖維素酶(復(fù)合酶)內(nèi)切酶（Cx酶）外切酶（C1酶）葡萄糖苷酶內(nèi)切酶作用于無定型的纖維素區(qū)域，使纖維素斷裂成片段又叫纖維二糖水解酶，它可以作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)或小片段纖維素，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖

3、分子，產(chǎn)生纖維二糖將纖維二糖分解成葡萄糖。 第四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）纖維素分解菌的篩選 1.剛果紅染色法； 2.剛果紅染色法的原理。四、實驗案例 土壤中纖維素分解菌的分離 第五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗的具體操作步驟如下: 1.土樣采集 土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。 2.選擇培養(yǎng) 選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250 mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1 mL和10

4、 mL的移液管、天平、搖床、溫度計等。第六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250 mL錐形瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報紙），用線繩扎緊，在121 下高壓蒸汽滅菌20 min。 選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20 g，在無菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 下振蕩培養(yǎng)12 d，至培養(yǎng)基變混濁。此時可以吸取0.1 mL培養(yǎng)液進行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進行梯度稀釋和涂布平板。第七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年

5、6月3.剛果紅染色法分離 纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1 mL移液管，裝有9mL無菌水的20 mL大試管，溫箱等。培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)基，在121 下高壓蒸汽滅菌20 min。倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入1520 mL培養(yǎng)基，凝固后待用。第八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 制備菌懸液： 按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至106。 涂布平板： 將稀釋度為104106的菌懸液各取0.1 mL，滴加在平板培養(yǎng)基

6、上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30 倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個稀釋度下需涂布3個平板，并注意設(shè)置對照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本資料三。第九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落： 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 （二）分離的結(jié)果是否一致： 由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于20

7、22年6月思考題1.本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？ 答：本實驗流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？ 答：由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？ 答：將濾紙埋在

8、土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10 cm左右腐殖土壤中。 第十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4.想一想，兩種剛果紅染色法各有哪些優(yōu)點與不足？你打算選用哪一種方法？ 方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。 方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖

9、維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。第十三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5.為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？ 答：在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。第十四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月6.學(xué)完這個專題后,你能否總結(jié)出分離培養(yǎng)微生物的一般方法?請用流程圖表示.土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將菌懸液涂布到有特定選擇作用的培養(yǎng)基上挑選單菌落發(fā)酵培養(yǎng)第

10、十五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月本課題知識小結(jié):第十六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)用途分選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物。例如：伊紅和美藍,和大腸桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)合,使菌落呈黑色（老教材說法：深紫色,帶有金屬光澤）, 鑒別大腸桿菌第十七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物

11、A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選 ，這種培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。目的菌 選擇 【例題解析】第十八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養(yǎng)基中的 ，實驗需要振蕩培養(yǎng)，由此推測“目的菌”的代謝類型是 ?；衔顰異養(yǎng)需氧第十九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于

12、2022年6月例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量 的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量 。 減少 增加 第二十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(4)轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時，常采用 方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。 劃線第二十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例1、(20分)某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難于降解的有機化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(目的菌)。實驗的主要步驟如圖所示。請分析回答問題：（北京卷）(5)若研究“目的菌”的生長規(guī)律，將單個菌落進行液體培養(yǎng)，可采用的方法進行計數(shù)，以時間為橫坐標(biāo)，以 為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。細菌數(shù)目的對數(shù)第二十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月例1