固定化酶與固定化細(xì)胞(2)

1、關(guān)于固定化酶和固定化細(xì)胞 (2)第一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 主要內(nèi)容 4.1 酶固定化技術(shù)發(fā)展史 4.2 固定化酶的定義 4.3 固定化酶的制備方法 4.4 固定化酶的特性 4.5 固定化細(xì)胞 4.6 固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用第二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1916年，Nelson和Griffin用吸附法實(shí)現(xiàn)了酶的固定化：將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，發(fā)現(xiàn)吸附以后酶不溶于水而且具有和液體酶同樣的活性。 4.1 酶固定化技術(shù)發(fā)展史 第三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹脂重氮化，然后將淀粉酶、羧肽酶、胃

2、蛋白酶和核糖核酸酶等酶與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。1969年，日本的千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。第四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月20世紀(jì)60年代后期對酶的固定化研究主要是將酶與水不溶性載體結(jié)合起來，稱為水不溶酶（water insoluble enzyme）和固相酶（solid phase enzyme）。1971年召開的第一屆國際酶工程會(huì)議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱Immobilized Enzyme。第五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1973年，日本的千畑一郎等使用固定化大腸桿菌

3、菌體中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。1976年，法國首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精。1978年，日本的鈴木等用固定化枯草桿菌生產(chǎn)-淀粉酶，開始了用固定化細(xì)胞進(jìn)行酶的生產(chǎn)先例。1986年，我國科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。第六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.2 固定化酶的定義 固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。第七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）可重復(fù)使用，使酶的使用效率提高、使

4、用成本降低。（2）易與反應(yīng)體系分離，簡化了提純工藝，產(chǎn)品收率高、質(zhì)量好。（3）穩(wěn)定性顯著提高，可較長時(shí)間使用或貯藏。（4）具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可用攪拌或裝柱的方式作用于底物液體，便于酶催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化。（5）固定化酶的催化反應(yīng)過程更易控制。（6）固定化酶比游離酶更適用于多酶體系的使用。第八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶的缺點(diǎn)：（1）固定化可能造成酶的部分失活，酶活力有損失。（2）酶催化微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化。（3）固定化使酶的使用成本增加，工廠初始投資增大。（4）固定化酶一般只適用于水溶性小分子底物，對大分子底物不適宜。（5）與完整菌體細(xì)胞相比，固定

5、化酶不適宜于多酶反應(yīng)。（6）胞內(nèi)酶進(jìn)行固定化時(shí)必須經(jīng)過酶的分離純化。第九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 固定化酶應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則： （1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。（3）固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、機(jī)械化操作。（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。（6）固定化酶的成本適中。4.3 固定化酶的制備方法第十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的固定化主要方法：吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法。吸附法和共價(jià)結(jié)合法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。第十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.3.1 吸附法（ad

6、sorption）定義：通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。 第十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月定義：通過物理方法將酶直接吸附在載體表面上而使酶固定化的方法。載體： 有機(jī)載體：纖維素、膠原、淀粉等； 無機(jī)載體：活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。 （1）物理吸附法(physical adsorption)第十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、價(jià)廉；條件溫和；載體可反復(fù)使用；酶與載體結(jié)

7、合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，固定化酶活力較高。缺點(diǎn)：由于靠物理吸附作用，酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過程中容易脫落。常與交聯(lián)法結(jié)合使用。第十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月定義：將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。載體：離子交換劑。 陰離子交換劑：二乙氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類(ECTEOLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等； 陽離子交換劑：羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。

8、（2）離子吸附法(ion adsorption)第十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等。此外，吸附過程同時(shí)可以純化酶。缺點(diǎn)：酶與載體的結(jié)合不夠牢固，易受環(huán)境因素如pH、離子強(qiáng)度、底物濃度等影響。第十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.3.2 共價(jià)鍵結(jié)合法(covalent binding）定義：將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。 酶分子中能與載體形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：（1）酶蛋白N末端的-氨基或賴氨酸的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天門冬氨酸的-羧基以及谷氨酸的-羧基。（3）酪氨酸的酚基。（4）半胱氨酸的巰基。（5）絲氨酸、

9、蘇氨酸的羥基。（6）組氨酸殘基的咪唑基。（7）色氨酸殘基的吲哚基。第十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的功能基團(tuán)： 芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等載體： 天然高分子衍生物：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖 合成高聚物：聚丙烯酰胺、多聚氨基酸 無機(jī)載體：多孔玻璃、金屬氧化物 第十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的側(cè)鏈基團(tuán)間一般不具有直接反應(yīng)的能力。通常反應(yīng)前先使載體上的功能基團(tuán)活化，再在比較溫和的條件下將酶和活化載體偶聯(lián)。載體活化固定酶法：重氮法、疊氮法、溴化氰法、烷化法第十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）重氮法 將載體活化成重氮鹽衍

10、生物，再與酶共價(jià)鍵相連接而固定化的方法。載體：多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。第二十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）疊氮法 即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)成固定化酶。載體：含有羥基、羧基、羧甲基等基團(tuán)，如羧甲基纖維素（CMC）、CM-sephadex（交聯(lián)葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物。第二十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）溴化氰法 用溴化氰將含有羥基的載體，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)。載體：具有連位羥基的高聚物，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等。第二十二張，PPT共

11、六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）烷化法和芳基化法 以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。載體：鹵素為功能團(tuán)，如鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。第二十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時(shí)間。 缺點(diǎn)：載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化。共價(jià)鍵結(jié)合法優(yōu)缺點(diǎn)第二十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.3.3 包埋法（entrapment）定義：將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法

12、。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。第二十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）凝膠包埋法 載體：天然凝膠：海藻酸鈉凝膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等合成凝膠或樹脂：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等。 （2）微膠囊包埋法 微膠囊材料：聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素 第二十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：方法簡單；防止酶滲出；酶回收率高。缺點(diǎn)：只適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶；高聚物網(wǎng)格或半透性膜對小分子物質(zhì)擴(kuò)散的阻力可能導(dǎo)致固定化酶的動(dòng)力學(xué)行為改變和活力的降低。包埋法優(yōu)缺點(diǎn)第二十八

13、張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.3.4 交聯(lián)法（cross-linking）定義：使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。酶蛋白的功能團(tuán)：氨基、酚基、巰基和咪唑基雙功能試劑：戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等第二十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月交聯(lián)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好缺點(diǎn)：酶活力損失大，交聯(lián)劑價(jià)格昂貴第三十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶不同方法的比較第三十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于

14、2022年6月4.4 固定化酶的特性4.4.1 固定化酶的形狀顆粒和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，宜用于工業(yè)生產(chǎn)。第三十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.4.2 固定化酶的性質(zhì) 固定化酶分子狀態(tài)從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。第三十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）酶活力 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合； 當(dāng)酶與載體結(jié)合時(shí)，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變； 酶被固定化后，雖不

15、失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。第三十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。第三十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）固定化酶的穩(wěn)定性 固定化酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)主要表現(xiàn)在：（1）操作穩(wěn)定性（2）貯藏穩(wěn)定性（3）熱穩(wěn)定性 （4）對蛋白酶的穩(wěn)定性 （5）酸堿穩(wěn)定性 第三十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 底物特異性 當(dāng)酶的底物為小分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。而當(dāng)酶的底物為大分子化合物時(shí)，固定化酶的底物特異性往往會(huì)發(fā)生變化。 酶底物為大

16、分子化合物時(shí)，底物分子量不同，對固定化酶底物特異性的影響也不同，一般隨著底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。 （3）固定化酶的反應(yīng)特性第三十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 反應(yīng)的最適pH 酶被固定后，其最適pH和pH曲線常會(huì)發(fā)生偏移，原因可能有三個(gè)方面： 一是酶本身電荷在固定化前后發(fā)生變化； 二是由于載體電荷性質(zhì)的影響致使固定化酶分子內(nèi)外擴(kuò)散層的氫離子濃度產(chǎn)生差異； 三是由于酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致固定化酶分子內(nèi)部形成帶電荷微環(huán)境。第四十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 反應(yīng)的最適溫度 固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，會(huì)受固定化方法以及固定化載體的影響。 米氏常數(shù) 使用載

17、體結(jié)合法制成的固定化酶Km有時(shí)變動(dòng)，主要是由于載體與底物間的靜電相互作用的緣故。Km值還與載體顆粒大小有關(guān)，載體顆粒越小， Km值在固定前后變化越小。 最大反應(yīng)速度 固定化酶的最大反應(yīng)速度與游離酶大多數(shù)是相同的。有些酶的最大反應(yīng)速度會(huì)因固定化方法的不同而有所差異。第四十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.4.3 固定化酶性質(zhì)改變的因素（1）微環(huán)境的影響（2）擴(kuò)散限制、分配效應(yīng)的影響（3）立體屏蔽的影響（4）酶分子構(gòu)象改變、化學(xué)改變的影響第四十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 擴(kuò)散限制效應(yīng)： 酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散限制：1）外擴(kuò)散限制是底物從宏

18、觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會(huì)使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。2）內(nèi)擴(kuò)散限制是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時(shí)的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散限制的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散限制。第四十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 分配效應(yīng) 由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主

19、體溶液稱為宏觀環(huán)境。 由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。第四十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月立體屏蔽固定化后由于載體空隙太小，或固定化的結(jié)合方式不對，使酶活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使效應(yīng)物或底物與酶的鄰近或接觸受到干擾，不易與酶接觸。第四十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 固定化細(xì)胞的優(yōu)越性： 無需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本； 可進(jìn)行多酶反應(yīng)，不僅可以作為單一的酶發(fā)揮作用，而且可以利用菌體中所含的復(fù)合酶系完成一系列的催化反應(yīng)； 對于活細(xì)胞來說，保持了酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對污染的

20、抵抗力更強(qiáng)； 細(xì)胞生長停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快。4.5 固定化細(xì)胞第四十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 固定化細(xì)胞的缺點(diǎn)： 必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度； 必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解； 胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)形成副產(chǎn)物； 載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙。第四十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化細(xì)胞的分類按細(xì)胞類型分：固定化微生物細(xì)胞、固定化植物細(xì)胞、固定化動(dòng)物細(xì)胞按細(xì)胞生理狀態(tài)分：固定化死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器）、固定化活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞）第四十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月固定

21、化細(xì)胞的性質(zhì)固定化對酶產(chǎn)生的某些影響對細(xì)胞同樣有表現(xiàn)，例如增加其穩(wěn)定性。由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對恒定和細(xì)胞的緩沖作用，固定化對胞內(nèi)酶產(chǎn)生的影響不像固定化酶那樣明顯固定化細(xì)胞除了受固定化因素影響外，還受細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜透性影響固定化活細(xì)胞還要考慮菌體生長、生理生化及它們在顆粒內(nèi)的分布等問題。第四十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（1） 酶活性固定化細(xì)胞的酶活力一般不下降或下降很小與固定化酶不同，還受到兩方面影響：一方面，由于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜存在，對底物、產(chǎn)物等效應(yīng)物的擴(kuò)散存在障礙，會(huì)使酶催化速率下降；另一方面，固定化的生長細(xì)胞可以活化增殖，使細(xì)胞密度和催化能力有所提高第五十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）穩(wěn)定性由于載體的緩沖作用，降低細(xì)胞對外部環(huán)境的敏感性，使固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性高于游離細(xì)胞。細(xì)胞膜的存在可以排除重金屬離子、有機(jī)溶劑等化學(xué)變性劑的作用，保護(hù)酶免受剪切力和氣泡等機(jī)械變性作用，使固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性高于固定化酶第五十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）反應(yīng)特性固定化對細(xì)胞的反應(yīng)特性的影響和固定化酶大致相同。還需考慮到：細(xì)胞增殖；細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散障礙；能使大分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的透性酶的主動(dòng)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。第五十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.6 固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用 4.6.1 工業(yè)上的應(yīng)用高果糖漿的生產(chǎn)酒精和啤酒生產(chǎn)