體內(nèi)藥分分析代謝物的測定

1、代謝物的測定-理論知識部分一.相關(guān)定義與前言藥物進入體內(nèi)后一般需經(jīng)歷物理變化和化學變化，物理變化是指藥物與生物大分子如血漿蛋白的結(jié)合反應(yīng)；化學變化是指體內(nèi)代謝反應(yīng)。體內(nèi)代謝反應(yīng)也稱生物轉(zhuǎn)化，分為一相代謝和二相代謝，一相代謝是指藥物在體內(nèi)發(fā)生的氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)。二相代謝是指藥物在體內(nèi)的結(jié)合反應(yīng)，包括：葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸綴合、谷胱甘肽綴合等。體內(nèi)藥物及其代謝產(chǎn)物的分析研究將為藥濃度、藥效和毒性之間的關(guān)系，為藥物作用機理及藥代動力學的研究提供科學的依據(jù)，因此近年來的進展令人矚目,已成為藥物研究的重要分支，并形成了一門新型的學科。1.1本節(jié)有關(guān)定義生物利用度

2、(Bioavailability):劑型中的藥物被吸收進入血液的速率和程度。生物等效性(Bioequivalence)：種藥物的不同制劑在相同的試驗條件下，給以相同的劑量，反映其吸收速率和程度的主要動力學參數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學差異。二研究代謝物測定的意義2.1測定藥物及其代謝物在血液組織及臟器內(nèi)的分布量，是衡量藥物的有效性和安全性的重要指標；2.2測定藥物及其代謝物濃度的經(jīng)時變化，提供可靠的藥代動力學數(shù)據(jù)；2.3研究藥物的代謝途徑，代謝物的藥理活性，生成與消除速度，對于合理用藥，避免藥物的毒性以及尋找新藥有一定意義。2.4有利于生物樣品的保存當生物樣品如血液采集之后，血漿酯酶有可能繼續(xù)水解樣品中

3、的酯類藥物，其他酶類也可能對樣品藥物繼續(xù)產(chǎn)生代謝反應(yīng)，因此，常需加入酶抑制劑。2.5有利于分析方法選擇大多數(shù)藥物的體內(nèi)代謝反應(yīng)，只是藥物分子結(jié)構(gòu)上某些基團的改變，使代謝物與母體藥物的化學結(jié)構(gòu)十分相似，從而導(dǎo)致某些物理性質(zhì)無較大差異，光譜分析及免疫分析法經(jīng)常面臨代謝物的干擾，欲測定生物樣品中的藥物和代謝物含量時，應(yīng)用色譜法是適當?shù)倪x擇，因其具備分離、分析功能，能避開代謝物的干擾或直接測定代謝物。2.6有利于選擇樣品分離、提取的方法藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后，生成的代謝物一般極性增大，水溶性增強，因此將藥物自生物樣品中分離、提取時，常利用它們之間極性和離解行為為的差別，選擇適當pH的緩沖液和溶劑系統(tǒng)將其分開

4、。三體內(nèi)代謝物需要被測定的情況3.1在做藥物的1期臨床藥代動力學試驗時，3.1.1如果已知有活性代謝物（藥理和毒理），并且濃度足夠高，可以測定a）研究的是其藥代情況，需要測定代謝物b）僅僅做生物等效性實驗，并且原藥可以測定時可以不測定代謝產(chǎn)物3.1.2如果已知有活性代謝物，但是濃度低，不易測定，可以不測定3.1.3如果代謝產(chǎn)物會影響藥物的代謝，分布和排泄時，在研究其藥代特征時應(yīng)該考慮進行代謝產(chǎn)物測定但是代謝產(chǎn)物是否在人體具有活性很難判斷，因為其是否有活性均是由其臨床前資料支持的。這時候可以參考05年3月版的化學藥物臨床藥代動力學研究技術(shù)指導(dǎo)原則和FDA的BioavailabilityandBi

5、oequivalenceStudiesforOrallyAdministeredDrugProducts-GeneralConsiderations（2003年）3.2在對生物樣品中代謝物濃度的檢測時，3.2.1代謝物能影響藥物的安全性和有效性時：藥代動力學研究：同時測定母體藥物和代謝物的濃度，等效性試驗：同時測定母體藥物和代謝物的濃度,等效性評價時以母體藥物作為主要判斷指標。322主要代謝物活性不清楚時：藥代動力學研究:測定母體藥物和代謝物濃度，等效性試驗:測定母體藥物濃度。3.2.3前藥濃度很低，代謝物為體內(nèi)主要存在形式時：藥代動力學研究:測定母體藥物和代謝物濃度，等效性評價:測定代謝物的

6、濃度。3.2.4前體藥物：藥代動力學研究:測定母體藥物（如果能測到）和代謝物濃度，等效性試驗:測定代謝物濃度。四代謝物測定時常用的生物樣本代謝物測定時常用的生物樣本血樣（血漿、血清和全血）、尿樣、唾液。常用生物樣本的采集與儲存：血漿全血加抗凝劑，離心，取上清液；血清全血離心，取上清液。采血后必須盡快離心分離出血漿或血清，置一20C以下冷凍保存。尿樣一一收集服藥后一定時間內(nèi)尿樣，記錄體積，混合均勻后取一定量，測定尿中藥物濃度，計算一定時間內(nèi)尿中藥物的累積量。唾液漱口15分鐘后收集口內(nèi)自然流出或經(jīng)舌在口內(nèi)攪動后流出的混合唾液，離心后取上清液。樣本采集后不能及時測定，可置4C冷藏，若放置時間較長，則

7、需-20C-80C冷凍保存。五代謝物測定的方法代謝產(chǎn)物的測定是藥物代謝研究中最經(jīng)典、同時也是十分有效的方法之一。由于藥物最終會通過與母核相關(guān)的一種或多種代謝物排出體外，因此，分離鑒定測定代謝產(chǎn)物可在一定程度上了解藥物的代謝途徑。近年來，HPLC,GC-MS,LC-MS及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR及LC-MS-NMR等高速、高效、高靈敏度的分析方法已用于代謝產(chǎn)物的分析和測定。5.1.HPLC的方法由于體液中藥物及代謝產(chǎn)物含量極微，又與大量內(nèi)源性成分相混雜，因此，只有分析方法可靠才能保證分析結(jié)果準確。氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）是分析微量乃至超微量化合物的有力工具，在這一領(lǐng)

8、域中應(yīng)用頗多。但是許多藥物和代謝產(chǎn)物缺乏揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，限制了它的應(yīng)用。近年來，高效液相色譜法（HPLC）以適用范圍廣、分離效率高、組分易回收及快速簡便為特點，伴以靈敏度高、選擇性強的檢測器的開發(fā)和應(yīng)用，在諸多的分析方法中后來居上，成為分析體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的不可缺少的手段之一。因為體內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物含量甚微，很難收集到足夠的樣品量測定四大光譜即紅外、紫外、核磁共振和質(zhì)譜。因此，以HPLC為工具定未知物就成為需要解決的難題之一。LC-MS雖然有效，卻因儀器價格昂貴不能廣泛應(yīng)用。目前仍常用以經(jīng)驗推斷的化合物為對為了去除內(nèi)源性成分的干擾，保證色譜柱的柱效和壽命，進行生物樣品的前處理是極其重要的。5

9、.1.1分離對于選用的不同的生物樣品類型進行不同的預(yù)處理。如血樣（包括血清、血漿）可直接上樣進行固相萃取，但若藥物與蛋白結(jié)合，則會降低萃取回收率，故要去除代謝物中蛋白質(zhì)，使結(jié)合型藥物釋放出來，以測定總濃度。得到較“干凈”的提取液，減少乳化，消除對測定的干擾。而唾液樣品則主要采用離心沉淀除去粘蛋白，取上清液測定藥物濃度。要測定尿液中的綴合物常需采用酸水解法或酶水解法使綴合物水解。常用去蛋白質(zhì)方法：蛋白質(zhì)沉淀法一一生成不溶性鹽或鹽析和脫水作用。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑包括有機溶劑（乙腈、甲醇、乙醇及丙酮等）、碳酸銨鹽、無機酸（三氯乙酸、高氯酸等）和重金屬鹽（汞鹽、鎢酸鹽及銅鹽等）。由于經(jīng)有機溶劑或酸處理

10、后的生物樣品與反相HPLC分析相匹配，因此應(yīng)用最為廣泛。組織酶消化法一一蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。近年來，用微孔膜濾除蛋白質(zhì)的方法已見報道，具有簡便快速的優(yōu)點，但只能測定游離狀態(tài)的化合物。用酸堿性離子交換樹脂去除與堿酸性化合物共存的蛋白質(zhì)，可同時完成純化和富集過程，因此也常被應(yīng)用。512提取從生物樣品中提取待測物通常有液相提取和固相提取兩種，分析超微量化合物時尤為必要。液相提取亦即溶劑提取，常用的有機溶劑有：正醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、苯及正己烷等等以及它們的混合溶液。有時為了減少乳化可加入少量的甲醇或乙醇。為了有效地提取酸、堿性藥物，通常需要調(diào)節(jié)樣品的pH，堿藥物一般調(diào)至

11、高于其pKa12個單位，酸性藥物則調(diào)至低于其pKa12個單位，使藥物處于非解離狀態(tài)而易被提取。提取高度電離的化合物（如季銨鹽或磺酸鹽）以及兩性化合物（如氨基酸）時，則須加入離子對試制。酸性化合物一般選用季銨鹽或叔銨鹽，堿性化合物則選用烷基或芳基磺酸鹽類以形成離子對，提高有機溶劑由于有機溶劑一般有毒易燃，蒸發(fā)去除溶劑可能引起待測物損失以及有時出現(xiàn)乳化現(xiàn)象等，因此，更為簡便有效的提取方法成為尋求的目標。其中固相提取法顯示出廣闊的前景。經(jīng)典的固相提取劑有氧化鋁、活性炭及硅藻土等。由于氧化鋁能選擇地吸附鄰酚羥基化合物，因此至今仍常使用，通常在弱堿性介質(zhì)ph8左右）中進行吸附，水洗去雜質(zhì)后用酸洗脫待測物

12、。影響液-液提取的因素：有水相pH值、提取溶劑和離子強度等1）水相pH堿性藥物：PH高于藥物的pKa23單位；酸性物質(zhì)：VpKa23單位2）提取溶劑提取溶劑的選擇既要考慮提取的選擇性，同時也要考慮操作是否方便，在滿足提取效率的同時選取極性盡可能小的溶劑，使既有合適的回收率，又可將干擾物質(zhì)降到最低。一般可根據(jù)相似相溶原則進行選擇，選擇沸點低的溶劑。當樣品中藥物性質(zhì)未知時，可用乙醚、氯仿分別作為酸性和堿性藥物的提取溶劑。3）離子強度在水相中加中性鹽，如NaCl，可增加離子強度，使溶液中水分子與無機離子強烈締合，導(dǎo)致與藥物締合的水分子減少，使藥物在水相中溶解度變小，有利于有機溶劑提取。4）有機相和水

13、相體積1:1或2:1影響液-固提取的因素：分離度和回收率是反映提取效率的重要指標，影響提取率的主要因素是：1）洗脫液流速一一流速太快，分離度下降，樣品流失，回收率低，重現(xiàn)性差。2）樣品裝載量有效裝載量取決于被測物的容量因子、固定相量和樣品濃度。過載，導(dǎo)致樣品流失。根據(jù)藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等選擇其預(yù)處理及檢測方法A）具有親脂性的藥物在適當?shù)膒H值下用溶劑萃取B）具有強極性或親水性的藥物選擇沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取的方法等C）具有揮發(fā)性的藥物選擇GC測定法D）具有光譜或電化學特性選擇分析檢測方法E）要根據(jù)藥物的穩(wěn)定性選擇萃取濃縮技術(shù)：對酸堿不穩(wěn)定避免使用強酸或強堿性溶劑，對熱不穩(wěn)定的藥物避免高溫蒸發(fā)溶劑，對光不穩(wěn)定的藥物避免見光。樣品處理步驟與分析方法的選擇如下圖所示圖2-L祥品笠理步舉與分析方注的選擇5.2其他測定代謝物的方法由于藥物最終會通過與母核相關(guān)的一種或多種代謝物排出體外，因此，分離鑒定代謝產(chǎn)物可在一定程度上了解藥物的代謝途徑。這時也可用特殊的分析手段