槐耳水提物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞增殖(共16頁(yè))

1、槐耳水提物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(dio wn)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖Ning Zhang1、Xiaoli Kong1、Shi Yan2、Cunzhong Yuan2和Qifeng Yang1,31山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院齊魯醫(yī)院乳腺(rxin)外科，2山東大學(xué)(shn dn d xu)醫(yī)學(xué)院齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，（收稿日期：2010年3月14日，修訂日期：2010年6月30日，接受日期：2010年7月9日；在線文稿接受日期：2010年7月16日）近年來(lái)，生長(zhǎng)在中國(guó)槐樹干上的槐栓菌（槐耳）在中國(guó)常被用于癌癥輔助治療；然而人們對(duì)槐耳的抗癌作用機(jī)制仍知之甚少。本研究旨在研究槐耳對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的

2、抑制作用，并探究其可能的抗癌作用機(jī)制。我們分別采用MTT、侵襲性測(cè)定以及細(xì)胞移行和體外劃痕試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力和移動(dòng)能力。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期分布以及PI-膜聯(lián)蛋白-V染色和羅丹明123測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，采用蛋白印記試驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞凋亡通路。我們發(fā)現(xiàn)槐耳提取物能時(shí)間和劑量依賴性地強(qiáng)烈抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞活力；但是，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)處理更為敏感。此外，細(xì)胞侵襲和移行能力也因加入槐耳提取物而受到抑制。我們還注意到，槐耳能有選擇地在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)G0/G1周期阻滯和p53積聚及活化。令人鼓舞的是，PI-膜聯(lián)蛋白-V染色測(cè)定和蛋白印記分析證實(shí)了半胱天冬酶3完成的細(xì)胞凋亡

3、。羅丹明123測(cè)定中，線粒體膜電位降低、BCL2下調(diào)以及BCL2相關(guān)X蛋白（BAX）上調(diào)，都說(shuō)明槐耳通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)凋亡?；倍T導(dǎo)凋亡期間的半胱天冬酶活化通過(guò)泛Caspase抑制劑Z-VAD-fmk得到確認(rèn)。與預(yù)期一致的是，抑制劑使兩種細(xì)胞系中的槐耳誘導(dǎo)凋亡均下降。根據(jù)我們的研究發(fā)現(xiàn)，槐耳能誘導(dǎo)ER陽(yáng)性和ER陰性乳腺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡，是一種有效的乳腺癌治療輔助藥劑。(CancerSci2010)預(yù)計(jì)世界上每年有100多萬(wàn)女性被診斷患有乳腺癌，并且每年約有41萬(wàn)人死亡(1)。乳腺癌已經(jīng)成為東南亞國(guó)家女性中僅次于胃癌的癌癥死亡主要原因(2)。在中國(guó)某些地區(qū)，乳腺癌發(fā)生率每年上升5%，高于全球

4、平均上升率(3)。在美國(guó)，與其它癌癥相比，乳腺癌預(yù)后較好，500多萬(wàn)存活者占了所有癌癥生存者的近23%。盡管一期和二期局部病變的5年存活率估計(jì)分別達(dá)到98%和94%(4)，但晚期乳腺癌的治療方式仍十分有限(5)。對(duì)于乳腺癌治療，常規(guī)治療方式很多，包括手術(shù)、放療、化療、激素治療以及其它輔助療法(6)。然而，這些療法不能完全防止癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此癌癥患者極需新的藥物和療法。在輔助療法中，傳統(tǒng)中藥（TCM）因其在殺滅癌細(xì)胞方面的奇特作用（低強(qiáng)度、更自然）而被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用(7)。在亞洲，中醫(yī)有三千年歷史。幾年前的一項(xiàng)回顧性分析證實(shí)，62%的可進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用或后期開發(fā)的抗感染和抗癌藥物都是源自自然的

5、藥物(8)。中藥含有多種復(fù)雜化合物，例如生物堿、類固醇和蛋白聚糖(9,10)，在安全劑量下可產(chǎn)生獨(dú)特的抗癌作用?；倍侵袊?guó)的一種藥用真菌，中藥名稱槐栓菌入藥歷史約有1600年(11)；但直到近幾十年，槐耳用于輔助療法的抗腫瘤性能才被發(fā)現(xiàn)和利用。真菌用熱水浸提兩次，并采用Sevag法清除游離蛋白和氨基酸。透析72小時(shí)后，在透析液中添加四倍量的乙醇以使有效成分沉淀。HPLC和SDS分析證明，槐耳提取物的有效成分是蛋白聚糖，其中包含41.53%的多糖、12.93%氨基酸和8.72%的水(12,13)（表S1）。另外，針對(duì)蛋白聚糖對(duì)S180鼠肉瘤細(xì)胞、H22肝癌細(xì)胞、Lewis肺癌以及MCF-7乳腺癌

6、細(xì)胞的抑制作用的研究證實(shí)，蛋白多糖是槐耳提取物中的主要有效成分。盡管蛋白聚糖在所有單獨(dú)的成分中最有效，其有效性仍低于槐耳提取物(12,13)。因而有理由推斷，槐耳提取物的活性可能來(lái)源于其協(xié)同或加性效應(yīng)?；倍崛∥锏目鼓[瘤作用呈現(xiàn)多種生物活性，例如細(xì)胞凋亡、抗血管再生、抗血管形成、耐藥性逆轉(zhuǎn)、抗轉(zhuǎn)移以及免疫系統(tǒng)激活。盡管最近實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示了細(xì)胞凋亡作用，但其潛在機(jī)制仍未得到詳細(xì)研究。另外，除細(xì)胞凋亡外，可能還存在其它抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)槐耳在乳腺癌細(xì)胞中的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了研究。材料和方法材料達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自Gibco-BRL (Rockville, IN，美國(guó))。

7、胎牛血清（FBS）由天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供?？?Bcl-2 (1:250), BCL2相關(guān)X蛋白 (BAX) (1:500)和p53 (1:1000)抗體購(gòu)自Dako Corp. (Carpinteria, CA，美國(guó))；磷酸化p53 (1:1000)和半胱天冬酶購(gòu)自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)?？剐∈驣gG辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)抗體(1:3000)由北京中山金橋提供。蛋白印記檢測(cè)用HRP介質(zhì)由天根生化科技（北京）有限公司提供。其它所有化學(xué)品均源自Merck (Darmstadt, Germany)和Sigma-A

8、ldrich (St Louis, MO，美國(guó))。3通信聯(lián)系人。E-mail: qifengy槐耳水提物的制備(zhbi)槐耳膏劑由蓋天力藥業(yè)有限公司（中國(guó)江蘇）贈(zèng)送(zn sn)。將2克膏劑溶于20毫升完全培養(yǎng)基中并進(jìn)行滅菌，用0.22 m濾膜過(guò)濾后得到100毫克/毫升(ho shn)儲(chǔ)備液，于-20長(zhǎng)期(chngq)儲(chǔ)存(14,15)。細(xì)胞培養(yǎng)將源自American Type Culture Collection (ATCC)的兩種乳腺癌細(xì)胞系（MCF- 7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞）以及NIH3T3成纖維細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（5%二氧化碳，37），添加10% FBS、

9、100 UmL青霉素和100 lg mL鏈霉素。細(xì)胞活力測(cè)定通過(guò)3-(4, 5-甲基噻唑-2-yl)-2, 5-二苯基溴化四唑(MTT)分析測(cè)定細(xì)胞活力。于5%二氧化碳和37條件下，將MCF-7（3103細(xì)胞 孔）和MDA-MB-231（1.5103細(xì)胞孔）細(xì)胞放進(jìn)96孔培養(yǎng)板中的DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、100 g mL青霉素和100 UmL鏈霉素）中培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)后，用含不同濃度槐耳的DMEM培養(yǎng)基替代DMEM培養(yǎng)基，并單獨(dú)培養(yǎng)24、48或72小時(shí)。隨后，在各孔中加入20 L的MTT（PBS中5 mgmL），并于37下再將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。然后小心吸取上清液，并在各個(gè)孔中添加100

10、L的二甲亞砜（DMSO）。將培養(yǎng)板搖動(dòng)10分鐘，并通過(guò)酶標(biāo)儀 (Bio-Rad, Hercules, CA，美國(guó))于570 nm下讀取吸光度值.(16)。使用完全DMEM培養(yǎng)基稀釋槐耳提取物，最終濃度為0、2、4、8和16 mgmL?；倍鷮?duì)細(xì)胞形態(tài)的影響使用濃度為4mg/ml的槐耳水提液對(duì)MCF-7和MDAMA-231細(xì)胞進(jìn)行24和48小時(shí)培養(yǎng)。在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)處理及陰性對(duì)照細(xì)胞的形態(tài)24和48小時(shí)，并且使用奧利巴斯（日本東京）數(shù)碼相機(jī)拍攝顯微照片。侵襲測(cè)定使用Transwell系統(tǒng)（24孔，聚碳酸酯膜孔徑8 lm；Corning Costar, Lowell, MA，美國(guó)），進(jìn)行

11、體外侵襲測(cè)定，以確定槐耳引起的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化。于37無(wú)血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞饑餓處理12小時(shí)。于37下，使用40 L基質(zhì)膠 (1.5 mg mL; BD Biosciences, San Jose, CA，美國(guó))對(duì)聚碳酸酯膜進(jìn)行2小時(shí)涂層，以形成再生基膜。向transwell下室中添加500微升NIH3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平衡混合物，并向上室添加1105MDAMB-231細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞懸浮于100 uL 0.1% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中，而在試驗(yàn)組中，培養(yǎng)基中還含有4 mg mL槐耳。經(jīng)過(guò)18小時(shí)培養(yǎng)后，用棉簽擦除基膜上表面以清除附著的細(xì)胞。然后將上室放

12、進(jìn)一個(gè)新的培養(yǎng)板中，使粘附在下表面的細(xì)胞在95%乙醇中保持10分鐘。Cell viability (of control) 細(xì)胞活力（對(duì)照組）Huaier extract (mg/mL conc.)槐耳提取物（ml/mL濃度）圖1 槐耳提取物抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的活力。通過(guò)MTT分析法測(cè)定槐耳對(duì)細(xì)胞活力的影響。(a) MCF-7和(b) MDA-MB-231細(xì)胞用槐耳處理24、48和72小時(shí)?；倍崛∥飼r(shí)間和劑量依賴性地顯著抑制兩種細(xì)胞系的細(xì)胞活力。所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)分別以平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示。(a) 0小時(shí)24小時(shí)48小時(shí)(b) 0小時(shí)24小時(shí)48小時(shí)圖2 槐耳提取

13、物使MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生(fshng)形態(tài)變化。添加槐耳（4 mg mL）前、后的(a) MCF-7和(b) MDA-MB-231細(xì)胞(xbo)的相差圖像于0、24和48小時(shí)時(shí)拍攝。最后，用吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞(xbo)染色。采用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡得出6個(gè)代表性區(qū)中侵襲和粘附于下表面的細(xì)胞計(jì)數(shù)(j sh)(1719)。移行(y xn)測(cè)定移行測(cè)定方法與上述侵襲測(cè)定基本相同，所不同的是移行測(cè)定不用基質(zhì)膠對(duì)基膜進(jìn)行涂層。向上室添加MDA-MB-231 (1105細(xì)胞孔)和MCF-7 (1105細(xì)胞孔)細(xì)胞，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，試驗(yàn)組的處理與侵襲測(cè)定相同。于37培養(yǎng)5小時(shí)后，以和侵襲研

14、究相同的方式進(jìn)行細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)(17)。體外劃痕試驗(yàn)為評(píng)估槐耳水提物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了劃痕試驗(yàn)。用0.1%和胰蛋白酶和0.1% EDTA完成消化后，分別以4105和2105的密度在24孔培養(yǎng)板中對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行接種。標(biāo)記靠近“劃痕”的參考點(diǎn)，確保得到同一位置的圖像，并將參考點(diǎn)置于37的培養(yǎng)板中。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天以便產(chǎn)生一個(gè)融合單層，并用p20微量移液“槍頭”末端劃痕，從而產(chǎn)生一條直線形無(wú)細(xì)胞的“劃痕”。用PBS沖洗各培養(yǎng)孔兩次，以清除碎片和使劃痕邊緣平滑，然后代之以無(wú)血清槐耳水提物 (4 mg mL)。然后，對(duì)

15、于第一張圖像，用相差顯微鏡拍攝匹配參考點(diǎn)“劃痕”中細(xì)胞的移行情況，隨后圖像間隔12小時(shí)拍攝(20,21)。通過(guò)ImageJ對(duì)圖像進(jìn)行定量分析；在參考點(diǎn)測(cè)量劃痕兩邊緣之間的距離并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞周期分析采用經(jīng)過(guò)修改的標(biāo)準(zhǔn)方法(22)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。簡(jiǎn)言之，在6孔培養(yǎng)板中對(duì)5105細(xì)胞/孔進(jìn)行接種，并在37無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓處理。饑餓12小時(shí)后，用槐耳溶液和完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24或48小時(shí)處理。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，用冷PBS沖洗，并使用含3% FBS的70%乙醇于-20過(guò)夜固定。第二天對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行1分鐘的1200g離心，并用PBS沖洗兩次。然后使用200 L RNase A (1 m

16、g mL)將細(xì)胞重懸，于37孵育10分鐘，接著添加300 L碘化丙啶 (PI, 100 lL mL)，于暗處對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA染色。室溫下孵育20分鐘后，用FACScan流式細(xì)胞儀 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ，美國(guó))分析細(xì)胞的DNA含量，并使用ModFitLT V2.0 軟件 (Becton Dickinson)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 control對(duì)照物 Huaier槐耳（4 mg/mL）Cell number細(xì)胞數(shù)量control對(duì)照物 Huaier槐耳圖3 在侵襲和移行試驗(yàn)中，槐耳提取物 (4 mg mL)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制。(a) 使用Tr

17、answell系統(tǒng)對(duì)MDA-MB-231進(jìn)行的侵襲試驗(yàn)表明，用槐耳進(jìn)行18小時(shí)處理后產(chǎn)生侵襲抑制作用。(b) 有或無(wú)槐耳處理情況下的成功侵襲MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量。(c) 經(jīng)5小時(shí)槐耳處理后的MDA-MB-231細(xì)胞移行試驗(yàn)。(d) 使用(shyng)基質(zhì)膠對(duì)基膜進(jìn)行涂層后，在對(duì)照組和槐耳處理組之間進(jìn)行MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量(shling)對(duì)比。(e) 5小時(shí)(xiosh)槐耳處理后的MCF-7細(xì)胞移行試驗(yàn)。(f) MCF-7細(xì)胞數(shù)量減少表明槐耳的抑制作用顯著。使用Giemsa染液，并完成6個(gè)代表性區(qū)段的細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)以平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)PI-膜聯(lián)蛋白-V染色進(jìn)行(jnxng

18、)細(xì)胞凋亡識(shí)別本試驗(yàn)旨在進(jìn)行細(xì)胞凋亡(dio wn)檢測(cè)，試驗(yàn)使用膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（晶美生物工程(shn w n chn)有限公司，中國(guó)北京），參照生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將得到的細(xì)胞置入100 L結(jié)合緩沖液中進(jìn)行重懸，使之達(dá)到1106/mL的濃度。接著添加5 L膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 L碘化丙啶 (PI, 20 g mL)，并于暗處孵育15分鐘。最后，在使用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分析之前，向各反應(yīng)試管添加400 L結(jié)合緩沖液。使用WinMDI V2.9軟件（The Scripps Research Institute, San Diego, CA，美國(guó))進(jìn)

19、行數(shù)據(jù)分析(22)。線粒體膜電位（MMP）測(cè)定通過(guò)不同濃度的槐耳進(jìn)行處理后，將獲得的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞懸置于PBS中。添加1L羅丹明123 (5 lg mL)，并于暗處37孵育1小時(shí)。然后用PBS沖洗細(xì)胞兩次并重懸。使用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定了10000個(gè)細(xì)胞的線粒體膜電位，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。蛋白印記分析以梯度時(shí)間（24和48小時(shí)）和濃度（4和8mg/mL），使用槐耳提取物對(duì)MDA-MB-231和MCF-7進(jìn)行處理。收集經(jīng)特別處理細(xì)胞的蛋白，并在含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中溶解(23)。通過(guò)12% SDS分離80g蛋白，并使用半干式印記儀器 (Bio-R

20、ad, Hercules, CA，美國(guó))轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂乳進(jìn)行封閉后，以一抗于4對(duì)基膜進(jìn)行過(guò)夜孵育，隨后使用二抗進(jìn)行標(biāo)記。使用Pro-lighting HRP試劑顯現(xiàn)蛋白帶。使用-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，對(duì)照組細(xì)胞在不含槐耳的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)評(píng)估使用軟件SAS V9.1 (SAS InstituteInc., Cary, NC，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Studentt檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)差異。P 0.05被視為差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果在MCF-7和MDA-MB-231中，槐耳抑制細(xì)胞活力并引起細(xì)胞形態(tài)變化。為評(píng)估槐耳提取物對(duì)MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞

21、的影響，在使用槐耳對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24、48和72小時(shí)劑量依賴性地處理后，我們通過(guò)MTT試驗(yàn)測(cè)定了細(xì)胞活力。如圖1所示，槐耳時(shí)間和劑量依賴性地對(duì)MCF-7 (圖1a) 和MDA-MB-231 (圖1b)細(xì)胞的活力產(chǎn)生顯著抑制。不論對(duì)于MCF-7還是MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞活力均在達(dá)到8 mg mL時(shí)急劇下降，并與處理時(shí)間無(wú)關(guān)。然而，MDA-MB-231顯示48和72小時(shí)時(shí)的細(xì)胞毒性更為明顯。經(jīng)過(guò)72小時(shí)4mg/mL濃度暴露后，MDA-MB-231細(xì)胞的活力幾乎下降80%，但MCF-7細(xì)胞活力僅降低42%。以4 mg mL濃度槐耳進(jìn)行24和48小時(shí)處理后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的形

22、態(tài)變化如圖2所示。與未經(jīng)處理細(xì)胞相比，絕大多數(shù)經(jīng)過(guò)槐耳處理的MCF-7細(xì)胞變大、形狀異常、呈刺狀以及產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)空泡變化（圖2a），而許多MDA-MBM-231細(xì)胞變得極長(zhǎng)，并呈現(xiàn)特殊的“拉絲”形態(tài)（圖2b）。這些形態(tài)變化表明，槐耳處理后發(fā)生了細(xì)胞損傷。細(xì)胞因暴露于槐耳提取物而運(yùn)動(dòng)能力下降為探究槐耳提取物是否影響細(xì)胞活力，進(jìn)行了體外侵襲、移行和劃痕試驗(yàn)。（圖中內(nèi)容）Control對(duì)照物 Huaier (4mg/mL) 槐耳（4mg/mL）Wound distance (of control distance) 損傷距離（對(duì)照距離）Control 對(duì)照物 Huaier 槐耳Time (h) 時(shí)間（

23、小時(shí)）圖4 劃痕試驗(yàn)(shyn)顯示損傷愈合過(guò)程延遲。 (a) 未經(jīng)處理(chl)及經(jīng)過(guò)4 mg mL濃度(nngd)槐耳處理的MCF-7細(xì)胞的圖像于0、12和24小時(shí)時(shí)拍攝。 (b) “損傷愈合”定義為各損傷處兩邊緣之間的起始距離百分率。經(jīng)過(guò)槐耳處理的MCF-7細(xì)胞顯示，其損傷愈合速度比對(duì)照細(xì)胞慢。 (c) 經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)槐耳處理(4 mg mL)的MDA-MB-231細(xì)胞的圖像于0、12和24小時(shí)時(shí)拍攝。 (d) 槐耳處理孔中劃痕兩邊緣之間的距離大于對(duì)照距離。與MDA-MB-231細(xì)胞(xbo)相比，MCF-7細(xì)胞被認(rèn)為(rnwi)是一種(y zhn)非侵襲性細(xì)胞系(24)，所以上述侵襲試驗(yàn)

24、未涉及MCF-7細(xì)胞。體外侵襲試驗(yàn)旨在對(duì)比經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)槐耳處理的MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲潛力。從圖3a、b中可以看出，穿過(guò)基質(zhì)膠涂層膜的侵襲細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組。體外移行和劃痕試驗(yàn)旨在從不同方面確定細(xì)胞的移行能力，兩種試驗(yàn)的結(jié)果一致。如圖3c、d所示，與未經(jīng)處理細(xì)胞 (93.67 6.66; P = 0.0006)相比，經(jīng)過(guò)4mg/mL濃度槐耳處理的MDA-MB-231細(xì)胞的移行運(yùn)動(dòng)受到顯著抑制 (39.67 7.02)。與其相似，與對(duì)照細(xì)胞 (19.67 4.73; P = 0.0188)相比，MCF-7細(xì)胞移行也受到相同濃度槐耳提取物的明顯抑制 (0.67 0.58)（圖3e、f

25、）。劃痕試驗(yàn)如圖4所示，各培養(yǎng)孔在開始時(shí)產(chǎn)生一個(gè)劃痕區(qū)域，而與之相比，槐耳處理（4mg/ml/）會(huì)延遲劃痕區(qū)域的閉合?；倍幚碚T導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的細(xì)胞周期捕獲，但在MDA-MB-231細(xì)胞中不存在經(jīng)過(guò)槐耳處理的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的周期分布通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，旨在確定抑制作用是否因細(xì)胞周期阻滯而產(chǎn)生。進(jìn)行處理和分析之前，兩種細(xì)胞均處于一系列不用槐耳濃度的培養(yǎng)基中，總處理時(shí)間為24或48小時(shí)。如圖5所示，與未經(jīng)處理細(xì)胞相比，處理組的MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期比例增加，從而說(shuō)明了G0/G1期阻滯。通過(guò)槐耳的處理還隨之降低了S相比例。這些結(jié)果表明，槐耳能通過(guò)G0/G1期的細(xì)

26、胞周期阻滯抑制MCF-7細(xì)胞增殖。然而，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)得的槐耳處理過(guò)的MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期分布類似于未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。通過(guò)PI-膜聯(lián)蛋白-V染色和MMP測(cè)定進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析可通過(guò)PI-膜聯(lián)蛋白-V雙重染色，可以區(qū)分完整細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞 (25)，因此為進(jìn)一步探究細(xì)胞凋亡問(wèn)題，我們進(jìn)行了此項(xiàng)測(cè)定。圖6和表1顯示，槐耳處理后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的晚期凋亡或細(xì)胞死亡率以及早期凋亡率呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性地升高趨勢(shì)。為探知槐耳誘導(dǎo)凋亡期間的半胱天冬酶活化情況，我們還研究了泛Caspse抑制劑Z-VADfmk對(duì)凋亡誘導(dǎo)的影響。和預(yù)期一致，泛抑制劑

27、使MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞經(jīng)槐耳誘導(dǎo)的凋亡減少。細(xì)胞凋亡與MMP降低有關(guān)(26)；因此我們使用羅丹明123測(cè)知MMP變化。圖7顯示，與對(duì)照組相比，槐耳處理導(dǎo)致MFI時(shí)間和劑量依賴性地降低，說(shuō)明槐耳處理嚴(yán)重影響線粒體的功能，從而引起兩種細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡?；倍幚砗蟮募?xì)胞周期捕獲和細(xì)胞凋亡機(jī)制因?yàn)閜53活化導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡，我們通過(guò)蛋白印記試驗(yàn)對(duì)p53和磷酸化p53 (p-p53)的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。如圖8a所示，p53和p-p53的表達(dá)時(shí)間和劑量依賴性地上調(diào)，表明槐耳的處理可以影響MCF-7細(xì)胞中的p53聚集和活化。Channels (FL2-A) 通路（FL2-A

28、）Number 數(shù)量Percentage of cells 細(xì)胞百分比Con 對(duì)照?qǐng)D5 .槐耳可以抑制細(xì)胞周期在G0G1 的反應(yīng)，(a)槐耳誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞G0G1的阻滯，(b)根據(jù)分布， 通過(guò)PI-膜聯(lián)蛋白-V染色進(jìn)行細(xì)胞周期凋亡識(shí)別后，最后通過(guò)流式細(xì)胞分析對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行評(píng)估由三組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照，得出數(shù)據(jù)是平均 SD，Control 對(duì)照物 Huaier (2mg/mL, 24h) 槐耳（2毫克/毫升，24小時(shí)）Huaier (4mg/mL, 24h) 槐耳（4毫克/毫升，24小時(shí)）Z-VAD + Huaier (2mg/mL, 48h) Z-VAD + 槐耳（2毫克

29、/毫升，48小時(shí)）圖6 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞(xbo)經(jīng)槐耳誘導(dǎo)(yudo)凋亡(dio wn)的流式細(xì)胞儀PI-膜聯(lián)蛋白-V的量化分析。 (a) 使用0、2和4mg/mL濃度槐耳進(jìn)行24或48小時(shí)處理的MDA-MB-231細(xì)胞的點(diǎn)圖。使用2mg/mL濃度槐耳提取物進(jìn)行48小時(shí)處理前1小時(shí)，向培養(yǎng)基中添加Z-VAD-fmk。(b) 使用0、4和8mg/mL濃度槐耳進(jìn)行24或48小時(shí)處理的MDA-MB-231細(xì)胞的點(diǎn)圖。使用4mg/mL濃度槐耳提取物進(jìn)行48小時(shí)處理前1小時(shí)，向培養(yǎng)基中添加Z-VAD-fmk。所顯示結(jié)果代表3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。表1 PI-膜聯(lián)蛋白-V染色凋亡(dio

30、wn)試驗(yàn)中的象限分布（QD）百分率QD對(duì)照24-224-448-248-4z-vad+48-2MDA-MB-231細(xì)胞系ULURLLLR2.620.102.410.3894.710.570.260.110.910.058.180.5287.230.753.670.454.083.408.840.4484.410.613.510.226.780.2110.640.3180.840.771.740.258.451.8714.223.5072.026.255.301.320.431.013.210.2994.470.181.890.13QD對(duì)照24-424-848-448-8z-vad+48-4_

31、 _ _ _ _ _ _MCF-7細(xì)胞系ULURLLLR0.910.201.490.1993.110.074.490.348.060.7311.892.6375.833.344.231.369.770.6021.470.2563.540.475.220.1814.340.316.470.1778.450.130.750.059.940.1919.280.2565.050.835.730.422.160.172.990.1890.480.114.360.33_3次實(shí)驗(yàn)(shyn)的數(shù)據(jù)均以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示(biosh)。LL Lower Left（左下）；LR Lower Right（右下）；U

32、L Upper Left（左上）；UR Upper Right（右上）。（圖中內(nèi)容）X Mean 平均值 Con 對(duì)照 Concentration濃度圖7 通過(guò)羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位（MMP）分析。使用槐耳提取物進(jìn)行系列處理后，(a) MDA-MB-231和(b) MCF-7細(xì)胞的MMP均時(shí)間和劑量依賴性地降低。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度顯示在各個(gè)圖形中，以平均值 表示。Con指control（對(duì)照）。然而在MDA-MB-231細(xì)胞中，未觀察到明顯p53聚集和活化（圖8b）。為進(jìn)一步研究槐耳引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過(guò)蛋白印記試驗(yàn)測(cè)定了Bcl-2、BAX、前半胱天冬酶-3和裂解的半胱天冬酶-

33、3的表達(dá)。如圖8中所示，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系分別為BCL-2高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系?；倍幚砜蓵r(shí)間和劑量依賴性地抑制Bcl-2表達(dá)及上調(diào)BAX表達(dá)。因此，Bcl-2與BAX的比率下降，引起線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為評(píng)估槐耳誘導(dǎo)凋亡的執(zhí)行通路，我們還通過(guò)蛋白印記法對(duì)前半胱天冬酶-3和裂解的半胱天冬酶-3進(jìn)行了測(cè)定。如圖8c、d所示，槐耳處理后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的半胱天冬酶活化顯著增強(qiáng)，從而引起裂解的半胱天冬酶-3表達(dá)增加，而前半胱天冬酶-3的表達(dá)降低。討論最近，中藥已成為開發(fā)新藥的豐富的資源，越來(lái)越多的中藥被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(27)。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)

34、槐耳水提物能抑制細(xì)胞的活力和移動(dòng)能力，并且還引起細(xì)胞形態(tài)變化。MTT試驗(yàn)表明，這種活力抑制作用表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性的方式?；倍鷮?duì)MDA-MB-231的細(xì)胞毒性作用比對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性更為明顯。另外，經(jīng)過(guò)槐耳處理后，可以觀察到一些典型的形態(tài)變化，說(shuō)明發(fā)生了細(xì)胞損傷。我們得出的結(jié)果還證實(shí)，槐耳作為誘導(dǎo)物，可通過(guò)p53活化于MCF-7細(xì)胞中引起G0G1期阻滯，但MDA-MB-231細(xì)胞中未觀察到這種作用。p53腫瘤抑制蛋白可以影響細(xì)胞在對(duì)DNA損傷及其它基因組異常的的反應(yīng)。p53活化可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡。磷酸化p53是p53活化形式之一(28)。鑒于MCF-7中的p53為野生型，其p5

35、3和p-p53的上調(diào)可以引起細(xì)胞周期的阻滯。然而，在MDA-MB-231細(xì)胞中， p53處于突變型且功能異常(29)。一般來(lái)說(shuō)，乳腺癌細(xì)胞可根據(jù)其雌激素受體（ER）狀態(tài)分為兩類，MCF-7細(xì)胞系呈ER陽(yáng)性，而MDA-MB-231細(xì)胞系呈ER陰性(30)。ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系通常預(yù)后更好(31)，而目前近三分之一的乳腺癌呈ER陰性，預(yù)后較差(32)。MDA-MA-231細(xì)胞被認(rèn)為是中度侵襲性的，而MCF-7細(xì)胞被視為一種非侵襲性細(xì)胞(24)。因此，重要的是要找到對(duì)ER陽(yáng)性和ER陰性乳腺癌均起作用的新藥。令人欣慰的是，PI-膜聯(lián)蛋白-V染色試驗(yàn)和蛋白印記分析證實(shí)了半胱天冬酶在兩種細(xì)胞系中均可以執(zhí)

36、行細(xì)胞凋亡。一些抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡構(gòu)成治療效果的一個(gè)重要方面。誘導(dǎo)過(guò)程中所涉及的兩個(gè)重要途徑已得到深入研究。一個(gè)通路是死亡受體途徑，另一個(gè)是線粒體途徑；后者被視為介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的重要途徑。我們?cè)贛MP實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)果同樣證實(shí)槐耳誘導(dǎo)凋亡的MMP下降。-actin -肌動(dòng)蛋白 Control 對(duì)照caspase-3 半胱天冬酶-3 Cleavaged caspase-3裂開的半胱天冬酶-3圖8 槐耳提取物對(duì)p53、磷酸化p53 (p-p53)、Bcl-2、BCL2相關(guān)X蛋白（BAX）以及(yj)半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)的影響。-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)(biod)作為(zuwi)內(nèi)參。(a,c) MC

37、F-7細(xì)胞和(b,d) MDA-MB-231細(xì)胞以4毫克/毫升濃度處理24或48小時(shí)，以及以8毫克/毫升濃度處理24或48小時(shí)。各種蛋白的表達(dá)均被量化為光密度值，并通過(guò)ImageJ進(jìn)行分析。(e) MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-2的不同表達(dá)。顯示的數(shù)值代表了三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。在線粒體途徑中，Bcl-2家族成員負(fù)責(zé)對(duì)不同情況下的細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡BAX蛋白(33)。關(guān)于本研究中使用的兩種代表性的細(xì)胞系，ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平高，但在ER陰性MDA-MB-231細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)水平很低。這個(gè)結(jié)果與過(guò)去的眼界結(jié)果一致(34)，并

38、被證實(shí)，Bcl-2表達(dá)呈現(xiàn)與ER狀態(tài)的正相關(guān)性(35)。另外，相同處理后兩種細(xì)胞系之間存在活力差別的原因亦不難推斷，因?yàn)镋R陽(yáng)性細(xì)胞具有過(guò)表達(dá)的抗凋亡Bcl-2蛋白，這賦予了其抗藥性(3638)?？紤]到槐耳水提物作為一種乳腺癌治療輔助藥物可起到一種奇特的作用，尤其對(duì)于三陰及晚期乳腺癌，將來(lái)的研究需針對(duì)其抗癌的機(jī)制。另外，我們還應(yīng)考慮槐耳提取物與化療、內(nèi)分泌療法以及放療等常規(guī)傳統(tǒng)療法之間的相互作用。綜上所述，我們的結(jié)果表明，槐耳提取物可通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯而抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果有助于理解槐耳的抗癌活性。最近，包含槐耳提取物進(jìn)行乳腺癌組合治療的研究已在進(jìn)行之中，我們熱切期待臨床試

39、驗(yàn)的結(jié)果。致謝本項(xiàng)目獲得以下部分資助：新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃、教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)108080）、國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)30772133）以及山東大學(xué)自主創(chuàng)新基金（由Yang Qifeng教授獲得）（IIFSDU，編號(hào)2009JQ007）。我們?cè)诖烁兄x以下人員所給予的技術(shù)支持及意見和建議。披露(p l)聲明作者(zuzh)無(wú)利益沖突。參考文獻(xiàn)1 Coughlin SS, Ekwueme DU. Breast cancer as a global health concern. Cancer. Epidemiol 2009; 33: 3158.2 Breast cancer in d

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