牛結(jié)核病防控相關(guān)進(jìn)展

1、牛結(jié)核病防控相關(guān)進(jìn)展牛結(jié)核病人型菌牛型菌人犬貓牛馬羊豬雞病原-致病性結(jié)核分枝桿菌屬 人型菌 & 牛型菌基因水平上99.95%同源感染譜相互交叉10%結(jié)核病人感染牛型菌人型菌可感染牛 (Chen, 2009)結(jié)核病防治的新挑戰(zhàn)？人 -牛人型與牛型結(jié)核菌結(jié)核菌在人與牛之間的傳播除非撲滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的。 世界衛(wèi)生組織第七次專家委員會報(bào)告牛結(jié)核是可以控制的美國1917年開始根除計(jì)劃，用約50年宣布根除牛的牛結(jié)核，但野生動物依然存在感染英國每年約花費(fèi)7000多萬英鎊控制牛結(jié)核澳大利亞1970至1997年歷時27年根除牛結(jié)核控制牛結(jié)核需要科學(xué)的方法加長期的規(guī)劃根除牛結(jié)核則需國家

2、大量的投入1. 流行病學(xué)傳染原：開放性結(jié)核病牛是主要的傳染源 引起牛結(jié)核病原牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌。引起（人）結(jié)核病原結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核桿菌其他動物結(jié)核病原靈長類與人相似其他哺乳動物與牛相似、禽類以禽型結(jié)核桿菌為主伯杰細(xì)菌學(xué)鑒定手冊分枝桿菌屬為2 大類: 緩慢生長分枝桿菌快速生長分枝桿菌（通常不致?。┛焖偕L分枝桿菌（ NTM ）目前發(fā)現(xiàn)NTM有150多種，僅20余種致病。代表性菌種為日內(nèi)瓦分枝桿菌致HIVAIDS發(fā)生播散型NTM病，并迅速致死。I群一光產(chǎn)色分枝桿菌代表性菌種有：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿猴分枝桿菌。群一暗產(chǎn)色分枝桿菌代表性菌種有：瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝

3、桿菌、蘇加分枝桿菌。群一不產(chǎn)色分枝桿菌代表性菌種有鳥一胞內(nèi)復(fù)合體分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、嗜血分枝桿菌。群快速生長分枝桿菌代表性菌種有：偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌。緩慢生長分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(或群) 結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌田鼠分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌 禽結(jié)核分枝桿菌副結(jié)核分枝桿菌宿主牛分枝桿菌主要引起牛結(jié)核病。也引起人類結(jié)核病。有5% 10% 以上的人結(jié)核是由牛分枝桿菌引起。還可感染牛、豬、人、鹿和大象等50 種溫血脊椎動物。 20 多種禽類。結(jié)核分枝桿菌主要引起人類結(jié)核病, 參考菌株為H37Rv;田鼠分枝桿菌引起鼠類結(jié)核病; 非洲分枝桿

4、菌引起人類結(jié)核病。主要感染途徑為呼吸道和消化道。相對來說，成年牛易經(jīng)呼吸道感染，而青年牛易經(jīng)消化道感染。呼吸道感染主要由帶菌塵?；驓馊苣z所造成。消化道感染則常因飼草、飼料被污染。犢牛感染主要是吮吸帶菌的乳汁造成的。此外，也可通過交配感染。傳染途徑易感動物牛人、豬、鹿和大象等50 種溫血脊椎動物。20 多種禽類。影響因素飼養(yǎng)管理不良，使役過度，與牛結(jié)核病的傳染有密切關(guān)系。特別是牛舍過于擁擠，通風(fēng)不良，潮濕，光線不好，是造成本病擴(kuò)散的重要因素。飼料配比不當(dāng)、飼料中缺乏維生素和礦物質(zhì)等，均可促進(jìn)本病的發(fā)生。牛結(jié)核的分布廣泛流行于世界各地尤以奶牛業(yè)發(fā)達(dá)國家為嚴(yán)重。地區(qū)流行或散發(fā)流行2012年全球牛結(jié)核

5、分布診斷1. 流行病學(xué)2. 癥狀 3. 病理變化4. 檢測病原免疫學(xué)試驗(yàn)結(jié)核病檢測膠體金-干擾素ELISAPPD皮試免疫學(xué)診斷分子生物學(xué)體液免疫細(xì)菌學(xué)診斷細(xì)胞免疫2.癥狀咳嗽虛弱消瘦呼吸困難咳嗽加重鼻孔干酪樣鼻汁胸部干性或濕性啰音、偶爾摩擦音體表淋巴結(jié)腫大臨床癥狀只能提示但不能確定該病。牛型結(jié)核分枝桿菌感染初期或輕度感染時，可能不出現(xiàn)臨床癥狀。通常呈慢性經(jīng)過，病初癥狀不明顯，患病較久，由于患病器官不同，癥狀亦不一致。 癥狀潛伏期活動期16-45d長者達(dá)數(shù)月，甚至數(shù)年、終生無明顯癥狀不發(fā)病肺結(jié)核肺外結(jié)核咳嗽病牛常發(fā)肺結(jié)核，易疲勞，常有短而干的咳嗽，尤其當(dāng)起立、運(yùn)動、吸入冷空氣或塵埃時隨后咳嗽加重

6、，頻繁且表現(xiàn)痛苦。呼吸次數(shù)增多或發(fā)生氣喘。消瘦消瘦，貧血，有的牛肩前、股前、腹股溝、頜下、咽及頸淋巴結(jié)等體表淋巴結(jié)腫大。當(dāng)縱膈淋巴結(jié)受侵害腫大，壓迫食道，則有慢性脹氣癥狀。病勢惡化，可能發(fā)生全身性結(jié)核，即粟粒性結(jié)核。胸膜、腹膜發(fā)生結(jié)核病灶時呈現(xiàn)所謂的“珍珠病”，胸部聽診可聽到摩擦音。乳房感染多數(shù)病牛乳房常被感染侵害，可見乳房上淋巴結(jié)腫大無熱無痛，泌乳量減少，乳汁初期無變化，病重時呈水樣稀薄。頑固性下痢腸道結(jié)核多見于犢牛，可表現(xiàn)為消化不良，食欲不振，頑固性下痢，迅速消瘦。性機(jī)能紊亂生殖器官結(jié)核可出現(xiàn)性機(jī)能紊亂，發(fā)情頻繁且表現(xiàn)性欲亢進(jìn)，慕雄狂與不孕。孕畜流產(chǎn)，公畜副睪及睪丸腫大，陰莖前部可發(fā)生結(jié)節(jié)

7、、糜爛等。神經(jīng)癥狀中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要是腦及腦膜發(fā)生結(jié)核病變，常引起神經(jīng)癥狀，如癲癇樣發(fā)作、運(yùn)動障礙等。禽型結(jié)核分枝桿菌感染可能無臨床癥狀，但亦可能出現(xiàn)昏睡和消瘦。在應(yīng)激條件下，可能發(fā)生突然死亡，這往往與嚴(yán)重的肝臟病變有關(guān)，象這樣的病變在死后解剖時容易觀察到。禽型結(jié)核分枝桿菌能引起人的一種漸進(jìn)性的難以治療的疾病。因此所有操作均須在有充分生物防護(hù)裝置的條件下進(jìn)行。人型結(jié)核分枝桿菌感染除靈長類動物會出現(xiàn)咳嗽等癥狀外，其他動物一般無明顯臨床癥狀。3. 病理變化牛型結(jié)核分枝桿菌感染病變可發(fā)生在所有內(nèi)臟器管最常見的是肺、胸膜、腸系膜淋巴結(jié)。感染早期，可在肺門部位及肺門淋巴結(jié)見到干酪樣壞死或鈣化的病灶。感染中

8、后期，可在胸膜、胸腔見到“珍珠狀”增生，形成所謂的“珍珠胸”。在腸系膜可見到串珠狀淋巴結(jié)腫大。分枝桿菌培養(yǎng)鑒定實(shí)驗(yàn)流程1、染色鏡檢確定是否是抗酸菌的培養(yǎng)陽性菌株2、確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是NTM首先經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗(yàn)、28生長試驗(yàn)、耐熱觸酶試驗(yàn)、觀察記錄細(xì)菌的生長速度、菌落形態(tài)和菌落顏色確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是NTM。3、確定該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群什么型進(jìn)行TCH生長試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)和煙酸試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。 結(jié)核菌素反應(yīng)與病變牛結(jié)核菌素陽性反應(yīng)，但剖檢時找不到病變。當(dāng)牛結(jié)核病在牛群中嚴(yán)重流行時，遇到這種情況不多。但對于牛結(jié)核病清凈的牛群，這種情況就

9、比較常見了。無病變的牛結(jié)核菌素陽性反應(yīng)是不是完全屬于非特異性反應(yīng)？這種情況很難作出明確診斷，因?yàn)橛行┡ｋm然感染牛型結(jié)核分枝桿菌，但病變很少或不明顯，解剖時不易發(fā)現(xiàn)，有的感染牛沒有任何病變。病原分離及鑒定病料淋巴結(jié)痰乳精液子宮分泌物尿和糞便病原檢測染色鏡檢培養(yǎng)特性動物試驗(yàn)生化試驗(yàn)分子生物學(xué)診斷 染色鏡檢涂片先在玻片上涂布一層薄甘油蛋白，甘油蛋白的配制：雞蛋白20mL，甘油20mL，水楊酸鈉，混勻。如檢驗(yàn)標(biāo)本為乳汁等含脂肪較多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脫脂12分鐘后傾去，再滴加95酒精以除去二甲苯，待酒精揮發(fā)后即可染色。然后吸取標(biāo)本滴加其上，涂布均勻。萋尼氏抗酸染色涂片后，經(jīng)火焰固定加石

10、炭酸復(fù)紅染色液用100mL 95酒精加3g堿性復(fù)紅配制成堿性復(fù)紅飽和酒精溶液，取堿性復(fù)紅飽和酒精溶液10mL，與5苯酚溶液90mL混合后用濾紙濾過將玻片在火焰上加熱至出現(xiàn)蒸汽（不能產(chǎn)生氣泡），如此熱染5分鐘（如染色液干涸，須加適量補(bǔ)充）。水洗后滴加3鹽酸酒精脫色3060秒（至無色素脫下為止）濃鹽酸3mL，95酒精97mL，混勻。水洗后，以駱氏美蘭染色液復(fù)染1分鐘。甲液：美蘭，95酒精30mL。乙液：氫氧化鉀溶液100mL?；旌霞闯伤矗?，鏡檢?？顾峋鷳?yīng)不被鹽酸酒精脫色而染成紅色，其他細(xì)菌與動物細(xì)胞可被鹽酸酒精脫色而均被染成蘭色。菌體形態(tài)牛結(jié)核分枝桿菌呈細(xì)長平直或微彎曲的桿菌，長微米，寬微米

11、.在陳舊培養(yǎng)基上或干酪性淋巴結(jié)內(nèi)的菌體，偶而可見長達(dá)10微米或更長培養(yǎng)將經(jīng)過處理的被檢樣品標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上（同時作24份）培養(yǎng)一天后，以熔化的石蠟封口，繼續(xù)培養(yǎng)。 牛型結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，初次分離培養(yǎng)時，需3637培養(yǎng)58周方可出現(xiàn)菌落。在固體培養(yǎng)基上不產(chǎn)生任何顏色，菌落濕潤、略顯粗糙并發(fā)脆。加1的丙酮酸鈉能促進(jìn)生長。若是非典型分枝桿菌，則生長較快，大部分（但不是全部）產(chǎn)生白色或具有橙色或黃色色素，常形成黃色或橙色菌落。某些種類的色素只有在亮處才顯出。BACTEC培養(yǎng)法利用放射性測定技術(shù)與培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的一種技術(shù)。BACTEC培養(yǎng)法商品盒試劑。本方法的優(yōu)點(diǎn)是：比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測到的菌量更低，

12、培養(yǎng)時間更短（只需28周左右）。本法的缺點(diǎn)是：費(fèi)用高，需專用儀器，需防止放射性污染。用動物分離豚鼠和家兔對牛型結(jié)核分枝桿菌敏感，雞對牛型結(jié)核分枝桿菌不敏感。處理過的病料，皮下或肌肉、腹腔內(nèi)注射接種后30天左右，進(jìn)行禽型提純結(jié)核菌素和牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)如有陽性反應(yīng)，可剖檢其中的半數(shù)動物進(jìn)行病理學(xué)觀察、細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢。另一半繼續(xù)觀察至3個月再剖檢觀察。如果為陰性反應(yīng)，可于40天左右剖檢其中的半數(shù)，觀察病理學(xué)變化、細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢，另一半繼續(xù)觀察至3個月再剖檢觀察。牛型、禽型和人型結(jié)核分枝桿菌鑒定動物試驗(yàn)試驗(yàn)動物豚鼠兔雞牛型結(jié)核分枝桿菌易感易感不易感禽型結(jié)核分枝桿菌不易感易感易感

13、人型結(jié)核分枝桿菌易感不易感不易感牛型、禽型和人型結(jié)核分枝桿菌鑒定生化試驗(yàn)：生化試驗(yàn)類型煙酸試驗(yàn)吐溫80水解試驗(yàn)?zāi)蜔峤佑|酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)T2H抗性試驗(yàn)牛型結(jié)核分枝桿菌禽型結(jié)核分枝桿菌人型結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)診斷DNA針擴(kuò)增從臨床樣品提取的靶序列，是來自熱休克基因，大小為402堿基對(bp)片段，336bp和123bp為重復(fù)片段，或者單獨(dú)插入對結(jié)核分枝桿菌特異的IS986、ISl081序列。PCR報(bào)道PCR能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。在實(shí)際應(yīng)用中，需要進(jìn)一步評價(jià)其特異性，特別是敏感性。擴(kuò)增片段可以看得見，可用生物素或地高辛代替同位素進(jìn)行標(biāo)記。免疫學(xué)試驗(yàn)結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)全

14、血試驗(yàn) 淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)、干擾素試驗(yàn) 血清學(xué)試驗(yàn)ELISA、膠體金結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)用結(jié)核菌素進(jìn)行的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是檢查牛結(jié)核病主要方法。亦是OIE指定國際貿(mào)易用檢測試驗(yàn)。試驗(yàn)分2種，一種是牛型結(jié)核菌素單一試驗(yàn)，僅用牛型提純結(jié)核菌素進(jìn)行，目的是檢測是否存在牛型結(jié)核分枝桿菌的感染。另一種是結(jié)核菌素比較試驗(yàn)，用牛型提純結(jié)核菌素和禽型提純結(jié)核菌素同時進(jìn)行，這是一種鑒別診斷試驗(yàn)，用以明確是牛型結(jié)核分枝桿菌感染，還是禽型或副結(jié)核分枝桿菌或其他分枝桿菌感染。皮試工具判定標(biāo)準(zhǔn)中國GB/T18645-2002OIE皮內(nèi)注射0.1ml(2000IU)牛結(jié)核菌素,72h后觀察皮厚,96與120h再觀察一次

15、牛結(jié)核菌素單用,或牛與禽結(jié)核菌素聯(lián)用,不少于2000 IU,72h后觀察陽性:皮厚差大于4mm陰性:皮厚差小于2mm可疑:皮厚差2-4mm疑似牛立即在另一側(cè)用同一批PPD第二次皮試,72h后觀察陽性:皮厚差大于4mm陰性:皮厚差小于2mm 可疑牛42天后重作皮試牛與禽結(jié)核菌素聯(lián)用時,牛結(jié)核菌素皮厚差大于禽結(jié)核菌素皮厚差4mm為陽性,1-4mm為可疑,小于或等于禽結(jié)核菌素皮厚差為陰性結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的特點(diǎn)世界動物衛(wèi)生組織OIE迄今為止唯一推薦的牛結(jié)核病的診斷方法非特異性反應(yīng)重癥牛敏感性低操作復(fù)雜煩瑣結(jié)果判斷主觀性大皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)比較試驗(yàn)本試驗(yàn)采用牛型提純結(jié)核菌素和禽型提純結(jié)核菌素同時進(jìn)行。操作

16、方法：在牛頸中部選2個點(diǎn)，一個在上1/3處一個在下1/3處。2個點(diǎn)之間的距離不得少于10cm。注射點(diǎn)及周圍的皮膚應(yīng)無異常。禽型提純結(jié)核菌素的注射劑量為每頭，含萬IU。即將禽型提純結(jié)核菌素稀釋成每毫升含萬IU后，皮內(nèi)注射毫升。牛型提純結(jié)核菌素的注射劑量為每頭，含萬IU。即將牛型提純結(jié)核菌素稀釋成每毫升含萬IU后，皮內(nèi)注射毫升。 結(jié)果判定a)牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性。對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)為陽性（局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于4.0 mm），并且對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)大于對禽型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)，二者皮差在2.0 mm以上，判為陽性。對已經(jīng)定性為牛型結(jié)核分枝桿菌感染的牛群。

17、其中即使少數(shù)牛的皮差在2.0 mm以下，甚至對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)略小于對禽型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)（反應(yīng)差小于或等于2.0 mm），只要對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)在2.0 mm以上，也應(yīng)判定為牛型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性牛。b)禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性。 對禽型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)大于對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)，兩者的皮差在2.0 mm以上，判為禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性。對已經(jīng)定性為副結(jié)核分枝桿菌或禽型結(jié)核分枝桿菌感染的牛群。其中即使少數(shù)牛的皮差在2.0 mm以下，甚至對禽型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)略小于對牛型提純結(jié)核菌素的反應(yīng)（不超過2.0 mm），只要對禽型提純結(jié)核菌素

18、的反應(yīng)在2.0 mm以上，也應(yīng)判為禽型提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽性牛。全血試驗(yàn) 除了傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗(yàn)方法外，現(xiàn)有了一些新的血液診斷試驗(yàn)方法。淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn)原理測定全血樣品中致敏淋巴細(xì)胞對結(jié)核菌素PPD抗原的細(xì)胞反應(yīng)性。這種試驗(yàn)具有科學(xué)價(jià)值，但在常規(guī)診斷中并不采用，因?yàn)樵囼?yàn)耗時，而且前期準(zhǔn)備以及試驗(yàn)操作都比較復(fù)雜(需要較長的孵育期，并使用放射性核甙酸)。然而，這種試驗(yàn)可用于野生動物以及動物園動物的檢測r干擾素試驗(yàn)本試驗(yàn)是測定全血培養(yǎng)系統(tǒng)中淋巴因子的釋放原理有特異性抗原(PPD-結(jié)核菌素)培育1624小時培育期間內(nèi)，致敏淋巴細(xì)胞釋放出r干擾素。用對牛r干擾素的兩種MAb，作夾心ELISA法

19、。 單抗1 單抗1+干擾素 單抗1+干擾素+單抗2IFN-檢測方法檢測OD值并確定IFN-g 水平抽取全血 ESAT-6CFP-10有絲分裂原對照將全血轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)孔中,加入抗原培養(yǎng)過夜吸取上層血漿進(jìn)行夾心ELISA檢測,溫育 60分鐘洗滌, 加底物,作用30分鐘后終止反應(yīng) TMB顯色I(xiàn)FN-g IU/mlOD 450nm標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟 1 全血培養(yǎng)步驟 2 IFN-gamma ELISA陰性對照IFN-釋放檢測特點(diǎn) 高特異性，高敏感性 外周血，24h出結(jié)果 比TST更貴，采血后在12小時內(nèi)檢測 BoviTB IFN-gamma kit 目前發(fā)達(dá)國家均以該方法輔助進(jìn)行結(jié)核病根除計(jì)劃樣品不能存放，在8小時內(nèi)進(jìn)行。此外，這種方法僅適用于