SDS-PAGE電泳技術(shù)

1、4.4 試劑和溶液（以下所用試劑均為分析純級(jí)）4.4.1 純化水4.4.2 A液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：稱取18.17g Tris加80ml純化水溶解，用6 mol/L 鹽酸調(diào)pH值至8.8，加純化水定容至100ml。4.4.3 B液（30%丙烯酰胺）：稱取29.1g丙烯酰胺，0.9 g N,N-甲叉雙丙烯酰胺于100ml燒杯中，加純化水溶解，用量筒定容至100ml，待其完全溶解后用濾紙過濾，避光4保存。4.4.4 C液（10%SDS）：稱取 10g SDS于100ml燒杯中，加純化水溶解，用量筒定容至100ml。4.4.5 D液：10%過硫酸銨溶液（4保存有效期為

2、3個(gè)月）。4.4.6 E液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：稱取12.11g Tris加80ml純化水溶解，用6 mol/L 鹽酸調(diào)pH值至6.8，加純化水定容至100ml。4.4.7 電極緩沖液母液（5），稱取15.1g Tris，94.0g甘氨酸，5.0g SDS加800ml純化水溶解，用6mol/L鹽酸調(diào)pH值至8.3，加純化水定容至1000ml。4.4.8 電極緩沖液，量取200ml電極緩沖液母液，加700ml純化水稀釋，再用6 mol/L 鹽酸調(diào)pH值至8.3，加純化水定容至1000ml。 4.4.9 供試品緩沖液，稱取0.303g Tris，0.189ml鹽酸，4

3、ml甘油，0.002g溴酚藍(lán)，0.8g SDS，加純化水定容至10ml，此溶液用于非還原SDS電泳，如用于還原SDS電泳，則再加2ml -巰基乙醇；4保存。4.4.10 考馬斯亮藍(lán)染色液，稱取1.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，250ml甲醇，50ml冰醋酸，加純化水溶解至500 ml。4.4.11 考馬斯亮藍(lán)脫色液，量取150ml 95%乙醇，75ml冰醋酸，加純化水至1000 ml。4.5 操作過程 4.5.1 制備分離膠（凝膠濃度15%）首先檢查玻璃板是否潔凈，如有污垢，需重新用純化水洗凈后用吹風(fēng)機(jī)吹干至室溫后再用。將長(zhǎng)短兩片玻璃板相對(duì)而放，長(zhǎng)玻璃板有間隔條的一面面向短玻璃板，兩玻璃板放在灌

4、膠框里夾緊，并確保兩玻璃板下邊緣在同一個(gè)水平面上，將裝有玻璃板的灌膠框安放在灌膠架上。一塊膠的配方量：用移液槍取純化水0.95ml、A液1ml、B液2 ml、C液0.04ml、D液0.025ml、TEMED 0.004ml于燒杯中，混勻，立即灌膠，并用11.5ml純化水封頂端，垂直放置約30min。4.5.2 制備壓縮膠 分離膠凝固后（觀察凝膠界面應(yīng)平直，否則為不合格分離膠，不能使用），倒去上層水，并用吸水紙吸干。配壓縮膠，取純化水1.4ml，B液0.33ml，E液0.25ml，C液0.02ml，D液0.02ml，TEMED 0.008ml，混勻，灌膠，并插入樣品梳，放置約40min。填寫凝膠

5、配制記錄（附件）。凝膠編號(hào)方法為年份兩位數(shù)月份日期各兩位數(shù)及當(dāng)天配膠流水號(hào)兩位數(shù)。4.5.3 樣品處理變性純化：將“上樣液”、“穿透液”、“洗脫液”三個(gè)樣分別與還原緩沖液按11、31、12的比例混勻，沸水浴1分鐘，8000rpm1min離心。沉淀溶解液：將樣品與還原緩沖液按13比例混勻，沸水浴1分鐘，8000rpm1min離心。復(fù)性純化：將“上樣液”、“沖洗液”、“洗脫液”分別與非還原緩沖液和還原緩沖液按11比例混勻，還原性電泳樣品沸水浴1分鐘，8000rpm1min離心，非還原性電泳樣品沸水浴0.5分鐘，8000rpm1min離心。原液：將樣品分別與非還原緩沖液和還原緩沖液按12比例混勻，還

6、原性電泳樣品沸水浴1分鐘，8000rpm1min離心；非還原性電泳樣品沸水浴0.5分鐘，8000rpm1min離心。成品：將樣品分別與非還原緩沖液和還原緩沖液按12比例混勻，還原性電泳樣品沸水浴1分鐘，非還原性電泳樣品沸水浴0.5分鐘。4.5.4 加樣待濃縮膠聚合后拔出樣品梳，將電泳緩沖液注滿電泳槽，在加樣孔中加入4.5.3所處理的樣品，原液、成品上樣量為1015 g，變性純化中“上樣液”、“穿透液”、“洗脫液”分別為20g、20g、10g，沉淀溶解液上樣10g，復(fù)性純化中“上樣液”、“洗脫液”上樣量15g，“沖洗液”1g左右，若“沖洗液”無(wú)蛋白則用非還原緩沖液代替。4.5.5 電泳接通電源，

7、一塊膠：以恒流30mA開始電泳，至待檢樣品進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)至60mA，直至電泳結(jié)束；兩塊膠：以恒流60mA開始電泳，至待檢樣品進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)至120mA，直至電泳結(jié)束。4.5.6 染色電泳結(jié)束后將玻璃板取出，用純化水將電泳槽沖洗干凈，然后將凝膠取下，放入電泳染色液中，用微波爐檔火力加熱約1分鐘，放在搖床上搖動(dòng)約10分鐘。玻璃板用純化水充分洗凈，放在架上自然晾干。4.5.7 脫色將凝膠從電泳染色液中取出，用純化水沖洗后，放入電泳脫色液（一塊膠約200ml）中，用微波爐檔火力加熱約1分鐘，之后放在搖床上搖動(dòng)15分鐘，更換脫色液3次，直至脫去背景顏色，再將凝膠轉(zhuǎn)入水中。4.5.8 干膠為保

8、留永久性記錄，可將染色的凝膠用Bio-Rad干膠膜制成膠片保存。我們實(shí)驗(yàn)室的SDS改良集錦】蛋白SDS電泳及定量在蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的方便修改。請(qǐng)仔細(xì)看各種細(xì)節(jié)改良，各種操作效果經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室5年驗(yàn)證?！疽弧?儲(chǔ)存液配制（均4冰箱保存，用完放回）（1）2 M Tris-HCl (實(shí)測(cè)pH 8.90.1，25) 500 mL：121 g Tris base加350 mL雙蒸水溶解，以玻璃棒攪拌約1 min，緩慢加入濃鹽酸（11.8 M）20 mL，繼續(xù)攪拌均勻，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入適量雙蒸水至500 mL，倒入無(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱保存。（2）100 g/L SDS

9、 溶液： 10 g SDS （要求高純度，其質(zhì)量明顯影響電泳效果）加100 mL雙蒸水，于潔凈的250 mL燒杯中進(jìn)行微波加熱溶解，注意不要爆沸，間歇用玻璃棒攪拌以加速溶解，完全溶解后的溶液應(yīng)清澈透明無(wú)色。倒入無(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱保存。冰箱取出后可微波加熱促進(jìn)儲(chǔ)存液的溶化。（3）75%（v/v）甘油：于500 mL量筒中倒入分析純甘油300 mL，加雙蒸水100 mL，以一次性塑料手套封口，顛倒量筒使甘油完全溶解，然后倒入無(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱保存。（4）10 g/L 溴酚藍(lán)溶液：500 mg溴酚藍(lán)加雙蒸水50 mL，攪拌溶解，倒入棕色玻璃試劑瓶中，4 冰箱保存。不用過濾。用時(shí)注意吸取上

10、層澄清液，不要吸到沉淀?！径侩娪竟ぷ饕号渲疲ň?冰箱保存，用完放回）（1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500 mL：于800 mL潔凈的燒杯中，依次稱取雙丙烯酰胺4 g，丙烯酰胺146 g，緩慢倒入雙蒸水約350 mL，以玻璃棒緩慢攪拌促進(jìn)溶解。注意，雙丙烯酰胺粉末易漂浮在空氣中，所以要稱重時(shí)注意周圍空氣流速，稱取丙烯酰胺時(shí)可以將燒杯中的雙丙烯酰胺掩蓋。玻璃棒攪動(dòng)幅度不要太大以免溶液底部的雙丙烯酰胺浮起并擴(kuò)散到空氣中。完全溶解的溶液應(yīng)清澈無(wú)色透明。待溶解完全后補(bǔ)加雙蒸水至500 mL，倒入無(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱可保存10個(gè)月。（2）4分離膠緩沖液，500 mL：于500 mL潔凈的量筒

11、中，依次加入375 mL 2 M Tris-HCl (實(shí)測(cè)pH 8.90.1，25)， 100 g/L SDS 溶液（冰箱取出后可微波加熱促進(jìn)儲(chǔ)存液的溶化）20 mL，最后加入適量雙蒸水至500 mL。倒入無(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱最少可保存12個(gè)月。有時(shí)冰箱溫度過低會(huì)使儲(chǔ)存液混濁，微波略微加熱使其澄清后即可使用。（3）100 g/L 過硫酸銨溶液 (ammonium persulfate, AP)20 mL：2g過硫酸銨加20 mL 雙蒸水，倒入無(wú)色塑料試劑瓶中，4冰箱最少可保存10個(gè)月。注意配膠時(shí)不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分裝到4個(gè)無(wú)色塑料試劑瓶中分別保存。（4）TEMED 成品

12、液：購(gòu)買后分裝成2或5 mL小管裝使用可避免母液受到污染。（5）5樣品緩沖液，100 mL：依次加入50 mL 75%（v/v）甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 溴酚藍(lán)溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (實(shí)測(cè)pH8.90.1，25)，5 mL巰基乙醇，9 mL雙蒸水?；旌夏敢旱谷霟o(wú)色玻璃試劑瓶中，4冰箱至少可保存12個(gè)月?？煞盅b成10 mL使用，不會(huì)使母液受到蛋白污染。（6）10電泳緩沖液，1000 mL： 稱取10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸（事先要明確甘氨酸溶液的顏色，選用溶解后澄清無(wú)色的產(chǎn)品）于1000 mL

13、的燒杯中，加水約700 mL溶解，可微波爐加熱（ 80）以促進(jìn)溶解，注意不要使其沸騰，加熱至燒杯燙手即可，間歇用玻璃棒攪拌。分裝至無(wú)色玻璃試劑瓶中，室溫最少可保存6個(gè)月。其pH值約為pH 8.40.1。【注意可省去pH6.8的濃縮膠緩沖液，用4分離膠緩沖液pH8.9的替代即可】【三】12% 電泳膠的配制要注意的是，配膠時(shí)分離膠的五個(gè)組分按下表依次加入潔凈的配制分離膠的小燒杯內(nèi)，以槍頭攪拌約10-20 sec，灌膠后再在膠面上小心地鋪上一幾毫米厚的水層（這可使凝固后的膠面平滑整齊），然后于37凝固15-30 min。而在配膠時(shí)濃縮膠只加前三個(gè)組分，混合液要于4冰箱保存，待分離膠凝固后再取出加入A

14、P和TEMED溶液，槍頭攪拌均勻，灌膠后插入梳子，然后于37凝固15-30 min。凝固的膠連帶其附著的玻璃板用塑料薄膜嚴(yán)密包裹可在4冰箱保存2-4天，長(zhǎng)時(shí)間保存易干膠，要重新做膠。12% 電泳膠的配制（10 mL）Table12% Gel componentsReagents Seperating gel Condensing gel二塊 30% Acr-Bis solution 4 mL 0.67 mL4seperating gel buffer 2.5 mL pH8.9 1 mL pH8.9H2O 3.5 mL 2.3 mL100 g/L AP 50 L 30 LTEMED 5 L 5

15、L4塊 30% Acr-Bis solution 8 mL 1.35 mL4seperating gel buffer 5 mL pH8.9 2 mL pH8.9H2O 7 mL 4.6 mL100 g/L AP 100 L 60 LTEMED 10 L 10 L六塊 30% Acr-Bis solution 12 mL 2.1 mL4seperating gel buffer 7.5 mL pH8.9 3 mL pH8.9H2O 10.5 mL 7 mL100 g/L AP 150 L 90 LTEMED 15 L 15 L其他濃度的電泳膠配制A% 電泳膠的配制（10 mL） TableA%

16、 Gel components（10 mL）Reagents Seperating gel Condensing gel二塊 30% Acr-Bis solution （A% *10mL）/30% mL 0.67 mL4seperating gel buffer 2.5 mL pH8.9 1 mL pH8.9H2O 補(bǔ)足10mL 2.3 mL100 g/L AP 50 L 30 LTEMED 5 L 5 L其中的H2O 補(bǔ)足10mL，所用的計(jì)算公式為：10mL-2.5mL- （A% *10mL）/30% mL 。例如6%的配方中，30% Acr-Bis solution 2 mL H2O 5.

17、5 mL 例如12%的配方中，30% Acr-Bis solution 4 mL H2O 3.5 mL 例如15%的配方中，30% Acr-Bis solution 5 mL H2O 2.5 mL【四】 考馬斯亮藍(lán)快速染色和脫色（極其好用?。┛捡R斯亮藍(lán)染色液 1000 mL：先稱取考馬斯亮藍(lán)R2501.0 g于1000 mL試劑瓶?jī)?nèi)，加入甲醇450mL溶解，再加冰醋酸100 mL和雙蒸水450 mL至大約1000 mL。室溫可放置12個(gè)月以上。染色液可倒入專用的回收試劑瓶，屆時(shí)加入適量甲醇、考馬斯亮藍(lán)和大約10 g/L的三氯乙酸后可重復(fù)使用。考馬斯亮藍(lán)脫色液 10 L：于10 L潔凈塑料桶內(nèi)裝入工業(yè)乙醇2 L，冰醋酸500 mL，加入去離子水至10 L，混勻，室溫可放置12個(gè)月以上。蛋白電泳凝膠的快速染色和脫色：凝膠的染色和脫色于合適體積的塑料盒中進(jìn)行。電泳后的凝膠加入染色液（以剛沒過凝膠即可），于微波爐加熱約40-70 sec至染色液剛剛沸騰（注意塑料盒的蓋子不要蓋的太緊以防染色液爆沸出），然后于脫色搖床上繼續(xù)染色約10 min即可。染色液請(qǐng)倒入專用的回收容器內(nèi)。以自來水小心地淋洗凝膠沖去剩余染料，然后倒入適量的脫色液，微波加熱至剛沸騰后于染色搖床上搖動(dòng)約10 min，倒掉