R-(-)-扁桃酸的生物合成研究進(jìn)展

1、R()扁桃酸的生物合成研究進(jìn)展扁桃酸又名*疑基苯乙酸，是極其重要的手性藥物中間體，具有消炎和殺菌的雙重作用。目前國際市場上扁桃酸需求約以年均10%左右速度增長，尤其是R-()扁桃酸早已成為國內(nèi)外急需的產(chǎn)品R()-扁桃酸及其衍生物是合成壞扁桃酯、疑節(jié)哇、匹莫林等血管擴(kuò)張劑、殺菌劑、鎮(zhèn)痙劑的重要藥物中間體,且具有很好的生物分解性，是目前最受魅目的酸性光學(xué)拆分劑，可使多數(shù)外消旋體胺類和氨基酸類經(jīng)非對映體異構(gòu)鹽形成法進(jìn)行光學(xué)拆分，如治咳藥甲嗎南的中間體八氫異喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。目前制備扁桃酸旋光性單體的方法人致有【習(xí)：物理化學(xué)法，其中包括不對稱合成法、光學(xué)異構(gòu)體拆分法和層析法等，不對稱合成法

2、可直接化學(xué)合成扁桃酸的異構(gòu)體，拆分法先合成外消旋體扁桃酸，再拆分獲得手性扁桃酸；生物合成法，國外文獻(xiàn)報(bào)道制備手性扁桃酸人致有3種方法HF：(1)以苯甲醛和氫輒酸為原料，先制得扁桃睛，后在膳水解酶的作用下,得到R()-扁桃酸。(2)先合成扁桃酸外消旋體，而后酯化或氨解獲得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺,再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用卞，得到單一對映體扁桃酸。(3)以苯乙酮酸為底物直接利用具有氧化還原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多數(shù)是形成R-(-)-扁桃酸，而s-(+)-扁桃酸則很少得到。其中，生物催化的手性合成反應(yīng)具有條件溫和、效率高、高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性以及對映體選擇性等優(yōu)點(diǎn)，且生物催化過程無

3、毒、無污染、能耗低，是一種壞境友好型合成方法，因而得到廣泛的應(yīng)用。總結(jié)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，主要可通過3種酶催化途徑制備R-扁桃酸：依賴于氧化還原酶體系催化合成R-扁桃酸；以扁桃酸甲(乙)酯作為原料，利用脂肪酶合成R-扁桃酸；以外消旋的扁桃購為底物，在睛水解酶的作用下，得到單一對映體扁桃酸。1氧化還原酶催化合成R-扁桃酸1.1以外消旋的扁桃酸為底物氧化還原酶生物催化法以外消旋扁桃酸為原料，在脫氫酶的作用卜選擇性氧化S-扁桃酸為苯乙酮酸，苯乙酮酸在不對稱還原酶的作用下被轉(zhuǎn)化為R-扁桃酸，在此過程中，原混旋體中的R-扁桃酸保持不變，如圖1所示。圖1選擇性氧化外消炭扁桃械中均S-扁桃酸來生物轉(zhuǎn)化為R-

4、扁桃酸Ganapati等首先將外消旋體扁桃酸用交換樹脂催化轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峒柞ィ笥眉俳z酵母中的水解酶立體水解成R-(-)-扁桃酸，光學(xué)純度達(dá)78%。并且建立了一個(gè)雙-雙酶水解動(dòng)力學(xué)模型。Tsuchiya等對敗血性支氣管產(chǎn)堿桿菌中的脫氫酶和糞鏈球菌中依賴于NADH的不對稱還原酶這兩種酶體系結(jié)合使用，將外消旋的扁桃酸生物轉(zhuǎn)化成單一異構(gòu)體的R型產(chǎn)物，其產(chǎn)量人于75%,R-扁桃酸的e.e值人于99%。另外，已報(bào)道可用于此類轉(zhuǎn)化的菌種有多色假單胞菌(Pseudomonaspolycolor)和藤倉赤痔菌(Gibberellafujikuioi)等刃。1.2以苯乙酮酸為底物苯乙酮酸已經(jīng)是一種廣泛使用、廉價(jià)

5、的化工原料，對其直接進(jìn)行不對稱還原，獲得高光學(xué)純度的R-扁桃酸，將減少一步酶促反應(yīng)叭TakaoM等小】利用鏈球菌、假絲酵母、腸球菌、紅酵母、酵母等中的還原酶將苯乙酮酸立體還原為R-(-)-扁桃酸，光學(xué)純度為100%。國內(nèi)郭黛蘋，許小平等心】通過對38株菌進(jìn)行初篩，獲得對底物苯乙酮酸具有較高轉(zhuǎn)化活性的出發(fā)菌株假絲酵母Ca.3o進(jìn)一步紫外與微波誘變，得到具有高轉(zhuǎn)化率與高對映體選擇性的突變菌株Ca.3.37.48。在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中，選擇初始底物濃度30mmoLLpH7.0、溫度32C的條件，R-(-)-扁桃酸得率86.5%,對映體過屋值為99.5%。肖美添等卩習(xí)以苯乙酮酸為原料，利用酵母細(xì)胞中的氧化還原

6、脫氫酶，合成了R-(-)-扁桃酸，構(gòu)型對映體過量值為95.1%。李忠琴等冋以苯乙酮酸為底物，從10株不同種類的菌株中篩選出具有不對稱合成(R)-扁桃酸S.cl活性的酵母菌，以此菌為出發(fā)菌株，進(jìn)一步采用紫外和微波復(fù)合誘變技術(shù)，分別篩選獲得突變菌S.C1-NIA16和S.cl-MEIO,構(gòu)型對映體過屋值達(dá)99.8%。黃雅燕等問考察了酵母菌株FDllb不對稱還原苯乙酮酸生產(chǎn)R-扁桃酸的重復(fù)使用性能。在持續(xù)6批次的還原反應(yīng)中，一直保持著較高的催化還原活性，且e.e值均高于96.5%,在30L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批放人試驗(yàn)時(shí)，還原反應(yīng)49h,產(chǎn)物收率為96.1%,e.e值為98.5%。1.3以外消旋苯基-1,

7、2-乙二醇為底物Oda等“利用微生物副百口咳博德特菌中的脫氫酶氧化外消旋的苯基-1,2-乙二醇合成光學(xué)活性的扁桃酸(如圖2所示)。在5.09/L苯基-1,2-乙二醇中，菌體可以積累產(chǎn)生2.09/LR-扁桃酸，e.e值達(dá)到95%。圖2苯基4,2乙一二爵轉(zhuǎn)化合成R-扁桃酸2脂肪酶生物催化合成R-扁桃酸脂肪酶法以混旋扁桃酸甲(乙)酯為底物，利用脂肪酶優(yōu)先與R-扁桃酸甲(乙)酯反應(yīng)生成R-扁桃酸這一特點(diǎn)，以控制在反應(yīng)初期生產(chǎn)具有較高e.e值的R-扁桃酸，如圖3所示。0H金C-COOCHSCHS-f-HzO2桃C-OOH-f-CHsCH2OH圖3扃桃酸乙酯轉(zhuǎn)化生桃酸高炳學(xué)，林金萍等采用實(shí)驗(yàn)室篩選到的釀酒

8、酵母LH1催化苯甲酰甲酸甲酯不對稱合成R-(-)-扁桃酸甲酯。Ganapati等首先將外消旋體扁桃酸用交換樹脂催化轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜峒柞ィ笥眉俳z酵母中的水解酶立體水解成R-()扁桃酸，光學(xué)純度達(dá)78%。Yadav等對脂肪酶在非水相介質(zhì)中催化水解外消旋扁桃酸甲酯制備R-扁桃酸進(jìn)行了研究。用離子交換樹脂IRA400作為催化劑通過酯化作用將外消旋的扁桃酸與甲醇混合制備外消旋的扁桃酸甲酯，再分離得到R-扁桃酸。用Novozym435脂肪酶特異性水解24h后，光學(xué)純度達(dá)78%,轉(zhuǎn)化率為19%。Wei等切利用微生物伯克霍爾德氏菌(Eiukholdenasp.GXU56)脂肪酶選擇性地將R,s-扁桃酸甲酯轉(zhuǎn)化

9、成R-扁桃酸。Palomo等【旳用乙二胺對固定化的脂肪酶進(jìn)行修飾，人人地改變了其活性、特異性以及立體選擇性，用CNB1-CAL-B對脂肪酶進(jìn)行化學(xué)修飾，R-扁桃酸的轉(zhuǎn)化率為50%,e.e值人于99%。高靜等口在非水體系中用脂肪酶N435作為催化劑水解扁桃酸乙酯外消旋混合物。R-扁桃酸乙酯的轉(zhuǎn)化率為41.6%,e.e84.O%。3水解酶生物催化合成R-扁桃酸睛水解酶是一類可以將膳轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酸及氨基的酶。當(dāng)以扁桃睛為底物時(shí)，脂肪族水解酶立體選擇性地生成R型扁桃酸，最重要的是其理論動(dòng)力學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物收率為100%。具體作用機(jī)制如圖4所示。扁桃稱CHO圖4開消旋扁機(jī)騰轉(zhuǎn)化生成R扁桃酸Endo等口】將消旋體

10、扁桃睛與Rliodococcus微生物反應(yīng)，酶催化水解扁桃席得到R-(-)-扁桃酸，R-(-)-扁桃酸的光學(xué)純度達(dá)100%oCes如等匸習(xí)采用來自木薯的有選擇性的s-氧睛酶和來自熒光假單胞菌EBC191的無選擇性的膳水解酶，分兩步轉(zhuǎn)化苯甲醛合成S-扁桃酸，產(chǎn)率很人，e.e值最高達(dá)98.0%。Yamamoto等匚勺利用AlcaligenesfaecalisATCC8750菌株的靜息細(xì)胞中睛水解酶催化外消旋扁桃膳得R-扁桃酸，產(chǎn)率為91%。Banerjee等戸】從假單胞菌中分離純化得到的睛水解酶對扁桃睛同樣具有立體選擇性，町以將扁桃膳水解成R-扁桃酸，具有較高的對映體過量值。Banerjee等“報(bào)

11、道海浹酸鈣固定P.putidaX1TCC5110細(xì)胞，利用睛水解酶水解扁桃膳，20個(gè)循環(huán)后固定化細(xì)胞仍具有88%的轉(zhuǎn)化活性，e.e為98.8%。近年來快速發(fā)展起來的基因工程和遺傳學(xué)也為進(jìn)一步高效地利用睛水解酶提供了理論基礎(chǔ)和可行性條件。DeSantis等【旳建立了一個(gè)睛水解酶庫，先從睛水解酶庫中篩選到有效水解扁桃膳生成扁桃酸的對彖。對其中一個(gè)產(chǎn)量較高的水解酶進(jìn)行研究，反應(yīng)3h后的產(chǎn)量為86%,e.e值為98%。Kaul等旳成功構(gòu)建含糞產(chǎn)堿桿菌(DSMZ30030)購水解酶基因的人腸桿菌重組菌，并以組氨酸作為標(biāo)記酶，鼠李糖作為誘導(dǎo)子，使重組菌有效表達(dá)睛水解酶。從細(xì)胞液中提取出席水解酶并純化后，制

12、備交聯(lián)酶聚集體，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液中含有85%(體積分?jǐn)?shù))的異丙醇和30nmioL-L戊二醇交聯(lián)劑時(shí)，交聯(lián)酶聚集體中睛水解酶的酶活是初酶活的80%,但其熱穩(wěn)定性人人提高，30C和60C時(shí)交聯(lián)酶集合體的穩(wěn)定性是酶溶液的5倍多，交聯(lián)酶集合體反復(fù)使用5次后，酶活僅僅降低10%。而Rey等【旳則對從糞產(chǎn)堿桿菌(ATCC8750)提取到的睛水解酶進(jìn)行固定化和基因修飾后發(fā)現(xiàn)，該固定化購水解酶能高度選擇性水解扁桃睛成R-(-)-扁桃酸，pH為8.5時(shí)，【I攵率為99%,對映體過量達(dá)到99%。Kiziak等將PseudomonasfluorescensEBC191中編碼睛水解酶的基因克隆到載體pJOE2775中，并在

13、人腸桿菌中表達(dá)。重組睛水解酶用于水解扁桃睛，反應(yīng)優(yōu)先水解得到R-扁桃酸，e.e值為31%。參考文獻(xiàn)STRAUSSQLRIKETTABER.KURT.Deraeeniizationof(士)mandeficacidusingalipase-mandelaterecemasetwo-eiizymeSystemJ.Tetrahedron-Asynmietry,1999.10(21):40794081.KAUL,PRAVEEN,BANERJEE.ANIRBAN,etal.Screenmgforenantioselecfivemtiilases:knieticresolutionofracemicman

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