SOP-PCR026-G 熒光PCR實(shí)驗(yàn)故障排除標(biāo)準(zhǔn)操作程序1.1

1、StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):SOP-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼1of15Writtenby編制人：sheng.xu徐晟Date日期：20120717EffectiveDate生效日期：DistributionScope發(fā)放范圍：PCR臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室Reviewedby審核者：QA填寫Approvedby批準(zhǔn)人：QA填寫Refertoaddendumfordocumentapprovalinformation文件審批信息請(qǐng)參考附錄ADNo.編號(hào)：S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼1of

2、15熒光PCR實(shí)驗(yàn)故障排除標(biāo)準(zhǔn)操作程序Purpose目的排除結(jié)果中存在的各種實(shí)驗(yàn)故障,分析故障原因并解決。Scope適用范圍臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室有上崗證技術(shù)員Definitions定義不涉及Responsibility職責(zé)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室有上崗證技術(shù)員識(shí)別熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的異常和故障，分析故障原因并解決排除故障。Process工作流程正常結(jié)果：擴(kuò)增曲線-AmplificationPlot標(biāo)準(zhǔn)曲線-StandardCurveStandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼2of15原始數(shù)據(jù)-Comp

3、onent匚:CirriF?口曰1|allE世SD=4QOOOD2OOOO口口1口0OOOOOO日口口口口357013I517T曰ZI21Z5HF251133373曰OO口1F5OOOOIjO1斗口口口口12OOOOOOUarparL*G*tEk1而fah*HOI|1XTiXHFJk5.1.4各波長(zhǎng)的原始信號(hào)-Spectra口KT匚）冊(cè)Hl-c-1o45f3BARBi54OOCD003口口口口口laOCCQQ14421aaaecDFillereJCycL*匝T5.1.5融解曲線-DissociationCurveStandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S

4、0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼3of15原始圖譜【導(dǎo)數(shù)圖譜異常結(jié)果分析及故障排除：沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線譏口TIXH)5TSSkifl百閻廣EHaxeP冷匕聞lulllIXmiiiJFirfi門【ii丨Lb1TwinEIcubmtI3皿腳訂RLn4D*rIhlpT4Hl：iH口0卩Eh】“弊LhY己I：SljMI!II廠5-li:?.：.,!l.I.:.i-可能原因?yàn)椋喝缦聢D所示，在WellInspector的對(duì)話框中,Task一欄沒(méi)有選擇“Standard項(xiàng),并且在Quantity一欄中未輸入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,而導(dǎo)致未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。VI1IIV=llAL40且目m口Lenaj

5、re:|屈i更議SS|LJkr;噩強(qiáng)最E扇IBi|-、“JjSfijLLip*工mint.:ruxmllLfui_l1L.-y_己iI八、IH吃，：工丁*I；Iii冷門I口BJkJW血|回口0”izJ!時(shí)fwIswc:-!:cir|HwJF4FC：1：MI：|41iwrhlliwr|T-mkIc4*ntd.tjf!LMNFAJlCnxanoJJJSta.krlStandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):SOP-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼4of15沒(méi)有擴(kuò)增曲線5.2.2.1原因1：PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤數(shù)據(jù)收集步驟只有一個(gè)循環(huán)，只收集了

6、一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼5of15UtatczTtianru-BlCttc-et=*col.丁a.Par11u|e_比vHecu:*口Tun嘗|I笙r七ariB曰口BinduUdL原因2：硬盤休眠電腦休眠，數(shù)據(jù)通訊中斷基線下滑從原始數(shù)據(jù)找原因：StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):SOP-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼6of151）1-9循環(huán)，ROX的信號(hào)下降，與試劑質(zhì)量有關(guān)；2）基線設(shè)定4-13范圍

7、內(nèi)，ROX信號(hào)值變化，F(xiàn)AM的信號(hào)值基本固定；FAM/ROX的校正后，基線不是水平的直線；3）應(yīng)該取ROX信號(hào)穩(wěn)定的10-20循環(huán)為合理的基線范圍。naardCurve修改基線范圍為10-20，重新分析：AnalysisSettings-AbsoluteQuantific.SI-CtAnalogisDctecti|AL1*盤Lit&Ct衣ManualCthreshoLd:|-200000LAutMaticEseLir時(shí)TfannlBasclineStart卩五廠rSue!K配SearLalyzelOKI-0ZD1CanceLD_AnaljcsisSettinES5r91113151719212

8、3252T3S3133353739AlloCi衣M33邱MD:Wtsdd:|l.im；112i葉宓|.二小=fmEtarllMlfa*WIndent汩lirp原因：基線的終點(diǎn)大于CT值。通常是因?yàn)槟０錎NA濃度偏高，門值15，而基線范圍仍然取3-15，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào),導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過(guò)高。解決方法：減小基線終點(diǎn)至CT值前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。樣品濃度跨度太大直線擴(kuò)增曲線StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼8of15解決方法如下圖：雙擊縱坐標(biāo)，打開GraphSettings，關(guān)閉

9、Y軸AutoScale,設(shè)置到正常范圍如0-12000。十鷺jftruHi_F:Lu!口zictTk戸1q十古ianrlajcdLUtjetfr:i.泊圧口c：kiat:Ldi.Kpmzri:嗎旨II口f!j-FaftSTli!.匯常胃亠.Pm口crimnt建議：將縱坐標(biāo)設(shè)置到適當(dāng)范圍，以觀全貌。5.2.8擴(kuò)增微弱或者信號(hào)很弱14Ul.l)OLU)120cmCycles9ROX信號(hào)不穩(wěn)定血tuJmtHUIlEntYr臺(tái)Sill恰Pl己tEySpectj;日yCcMnudDugnlYAmuLificti口口PlotSt衛(wèi)口勺廿4ComponentCom口onentKQDaEGanpjnsit(s

10、)SOQOlfllyE匚tit口CoMipondi-tAmfiiI.if7iua.ti14QO.OO13aa.DC1000.00BOO.DD6OD.DDdQ0.001357g1113151719211J匚ua*0nlluFA融73n-2325233728ussu_FlateTS陽(yáng)utr包yoniponertYAmpLifiwtion卩l(xiāng)otStandard33001aii艸竹怙刑側(cè)啊:斜血河血皿躬IRFAM3uv0!5Qni-d顧QI3000.08MDJ1Eioocloii11irgni15itignb35rsjiJ3hjtqr皿Cycles|I7FAHI-KinUdm門。廠it160D.DD

11、StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼9of15擴(kuò)增曲線不光滑Rn原因：信號(hào)太弱4000-400StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼10of15解決方法：1）使用高質(zhì)量的探針。2）補(bǔ)救方法：關(guān)閉ROX校正，重新分析數(shù)據(jù)。關(guān)閉SX校正3）關(guān)閉ROX校正的效果24D0Z0D016D012008D0157S111915171921232527292193962799StandardOperat

12、ingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼11of15重復(fù)性很差：1.09-00131.如0iae+OOO1.0e-0021.0e-00i-4uct-苕正常的原始數(shù)據(jù)Instfuii礙MX陞EUltis/IPlatok忌閃為帕上農(nóng)命帀po門心就kA麗Ifi亡哉IonPbl&StMdcrcIQyw人DI騎citation人刖訊rt)UonnpDnQnt0.00112000.0010000.00eooo.ooSBODD.OO|4000.002000.0079111315171921232fi27293133353739Cycl

13、es原因：蓋子未蓋緊，溶液蒸發(fā)Setup人Inglrun晶iResults/&比曰才恂入Cojnooreirt人ArnmilcallonPlotk矽即的陽(yáng)Cm%人D曲工iallonX尺郎ort7匚口蝕口門m4400.00ZUBusgn-LL4000.00Com口口口匕仃匕孑PFMPF凸MRAPROX3600.003200.DO2800.DO2400.002000.001600.001200.00山坡形擴(kuò)增曲線StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):SOP-PCRO26-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼12of15汽F匚Sj現(xiàn)-Hz:應(yīng)止5出Lbh

14、y已亜!l=aastaF?nrsi二wcbaiij-i5-:rsifl11is13ifl13i?iriiid丹ciizrz=ms*as-硏刊mk?ii雷j;hts船ifri汕畑11a匚燭Mjtfcr察看ROX數(shù)據(jù)一顯示有蒸發(fā):河DDO:iMDmmodo1410DOI9IDD0sL6w5nHpanDi?ni!Hl需復(fù)查的異常曲線樣本濃度太高或者存在抑制劑（需重新稀釋樣本進(jìn)行檢測(cè)）StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：1.1Page頁(yè)碼13of15Data:|DeltaRnvsCycleDetector:All-

15、AnalysisSettingsAutoCtf*ManualCtThreshold:126226.04CAutoBaselin總荷ManualBaseline:Slart(cycle):IPlFileViewToolsInstrumentAnalysisWindowHelpulxEoclLineColor:|wellColorEnd(ccle):|15123456891011AQ01Q01Q19Q19QBlmBIS01H01QQQBBCQ01Q01QQQSBD19豈Qmm10El19ElBEQSQ01QQQBlBFQS1901QQQBGQS19QQmqmaBHQQEl01QQmQuqa圍固函k

16、甥繆Setup丫InstrumentyResuttsPlateySpectreycomponenf40K20KOK-20K-40K-60K-SOK-100K-120K-140K-160KDmlt自Rn船CyclmData:DeltaRnQCycleDetector:何刁LineColor:|wellColor-AnalysisSettingsCAutoCtFManualCtThreshold:126226.04廠AutoBaselinef*ManualBaselinm:Start(cycle):(6345678910111213141516171819202122232425262728293

17、031323334353637383940End(ccle):|15Cyul”NumhEr-”-”了8|9|101112P：start匚e7300System5D55of.Wuntitled-Paint國(guó)7300SystemSDSSoftware-20120616hhbv-3.sds(AbsoluteQuantification)StandardOperatingProcedure標(biāo)準(zhǔn)操作程序ADNo.編號(hào):S0P-PCR026-GVersion版本：l.lPage頁(yè)碼14of15沒(méi)有熒光信號(hào)司7300SystemSDSSoftware-2012O4O2ZX-2.sds(AbsoluteQua

18、ntification)ComucinEntPlFileViewToolsInstrumentAnalysisWindowHelp6.004.00aCJLlmCJs(IIcln匚21273-1372.00Readydisconnecteduntitled-PaintDeI怕Rn眉CyclEFileViewToolsInstrumentAnalysisWindowHelp&XData:DeltaRrTvsCycle”Detector:何LineColor:|wellColor三-4-61245678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940-如alisisSettingsCAutoCtf*ManualCtThreshold:15736.369CAutoBaselineManualBaseline:Start(ccle):|6End(cycle):|15AnalyzeICycleNumberHelpReferences相關(guān)文件（無(wú)）Records相