微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)課件

1、第三章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù) A：研究微生物的途徑：（群體）培養(yǎng)物：在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)，繁殖得到的微生物群體。純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。（利于研究、應(yīng)用、重復(fù)結(jié)果）B：利用顯微技術(shù)進(jìn)行研究顯微技術(shù)包括顯微標(biāo)本的制作、觀察、測(cè)定、分析及記錄等方面的內(nèi)容。 第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng) 無菌技術(shù)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 單細(xì)胞（單孢子）分離 選擇培養(yǎng)分離 一、無菌技術(shù) 無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)(物)時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)。 保持無菌的方法 高壓蒸氣滅菌高溫干熱滅菌棉塞超凈工作臺(tái)等 接種操作 二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 菌落：?jiǎn)蝹€(gè)微生物

2、在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體。菌苔：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。菌落菌落或菌苔是對(duì)微生物進(jìn)行分類和鑒定的重要依據(jù)。細(xì)菌菌落特征剖面圖細(xì)菌菌落特征正面圖菌落培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板（平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。 平板分離微生物純培養(yǎng)技術(shù) 稀釋倒平板法 涂布平板法 平板劃線分離法 稀釋搖管法 1、稀釋倒平板法：無菌水、梯度稀釋、50左右的瓊脂培養(yǎng)基、滅過菌的培養(yǎng)皿。注意要稀釋得當(dāng)。分離出單個(gè)菌落以后，重復(fù)上述操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。Pour plate稀釋倒平板法涂布平

3、板法Spread plate無菌水、梯度稀釋涂布平板 稀釋倒平板法和涂布平板法平板劃線分離法稀釋搖管法用于分離嚴(yán)格厭氧菌。先將一系列盛有無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋，試管迅速搖動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基與空氣隔開。 三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 用于細(xì)胞大的細(xì)菌、原生動(dòng)物和藻類等的純化分離。稀釋法：經(jīng)高度稀釋后，同一個(gè)稀釋度的試管中大多數(shù)（95%以上）表現(xiàn)不生長，很可能得到的是純培養(yǎng)。 四、單細(xì)胞（單孢子）分離 單細(xì)胞分離：采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培

4、養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比。個(gè)體較大的可在低倍顯微鏡下進(jìn)行，個(gè)體較小的則需采用顯微操作儀。五、選擇培養(yǎng)分離 當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其他微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的，故需采用選擇培養(yǎng)分離法。1、利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離 如要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上進(jìn)行分離。 2、富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條

5、件：物理、化學(xué)和生物等。以從土壤中分離能降解酚類化合物對(duì)羥基苯甲酸的微生物的實(shí)驗(yàn)為例。六、微生物的保藏技術(shù) 保藏期間微生物不死亡、不污染、不會(huì)因發(fā)生而丟失重要的生物學(xué)性狀。許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏委員會(huì)美國典型菌種保藏中心世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)等 菌種保藏菌種保藏：就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。 對(duì)于生產(chǎn)中使用的菌種保藏培養(yǎng)基，要求比較豐富的氮源，以防止菌種退化變質(zhì)。菌種保藏方法連續(xù)移接改變條件（干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）使菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達(dá)到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時(shí)間內(nèi)得到保藏，有的可保

6、藏幾十年或更長的時(shí)間。在需要時(shí)再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。 1、傳代培養(yǎng)保藏是微生物保存的基本方法。瓊脂斜面、半固體瓊脂柱和液體培養(yǎng)等。橡皮塞封口或用石蠟覆蓋，并放置低溫保存。4保存。2、冷凍保藏 代謝作用停止。細(xì)胞體積大者要比小者對(duì)低溫更敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁敏感。其原因是低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜的損傷。速凍及快速解凍可減少損傷；還可加一些保護(hù)劑，如0.5%左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)因此在采用冷凍法保藏菌種時(shí)，一般應(yīng)加入各種保護(hù)劑以提高培養(yǎng)物的存活率。 3、干燥保藏法 沙土管保存和冷凍真空

7、干燥保藏是最常用的二項(xiàng)微生物干燥保藏技術(shù)。 沙土管保存 一般將菌種接種至斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸浮液，加入無菌沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、橡膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等，保藏時(shí)間相對(duì)較長。 冷凍真空干燥保藏 是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過水的升華作用除去水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動(dòng)處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。用水升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對(duì)比較小，存活率及保

8、藏效果均不錯(cuò)，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。 第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù) 顯微鏡的種類及原理 顯微觀察樣品的制備 一、顯微鏡的種類及原理 普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡 普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成。機(jī)械裝置：保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制，用于固定材料和觀察方便。分辨率重要性能參數(shù)。顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨率（resolution）有關(guān)。分辨率是指顯微鏡（或人

9、的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力。分辨率的大小決定于光的波長和鏡口角以及介質(zhì)的折射率。分辨率肉眼分辨率一般只有0.25mm光學(xué)顯微鏡分辨率0.18m電子顯微鏡可達(dá)0.2nmR=0.5 /sin/2式中：n=介質(zhì)折射率；=鏡口角（標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口的張角），sin/2 =鏡口率介質(zhì)空氣水香柏油溴萘折射率11.331.5151.66二、顯微觀察樣品的制備 要根據(jù)顯微鏡和樣品的特點(diǎn)來制備。主要講述光學(xué)顯微鏡的制樣。 1、活體觀察壓滴法：將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻片后立即進(jìn)行顯微鏡觀察。懸滴法：在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上后進(jìn)行顯微鏡觀察，為防止液滴蒸發(fā)變干，一

10、般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林。菌絲埋片法：將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對(duì)菌絲的形態(tài)進(jìn)行觀察。插片法： 2、染色觀察固定的目的：殺死細(xì)菌并使菌體粘附于坡片上。增加細(xì)菌對(duì)染料的親和力。常用的方法有酒精燈火焰加熱和化學(xué)固定二種。 細(xì)菌染色法死菌正染色負(fù)染色：簡(jiǎn)單染色法鑒別染色法 革蘭氏染色法 抗酸性染色法芽 孢 染 色 法莢膜染色法等 活菌: 用美藍(lán)或TTC（氯化三苯基四氮唑）等 作活菌染色 姬姆薩染色法染色觀察第三節(jié)顯微鏡下的微生物 微生物類群包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類，這里主要介紹細(xì)胞型微生物。 細(xì)菌和古生菌 真菌 藻類 原生動(dòng)物

11、 一、細(xì)菌和古生菌 細(xì)菌的形態(tài)和排列古生菌原核生物的細(xì)胞大小 1、細(xì)菌的形態(tài)和排列球菌(Coccus)桿菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形狀的細(xì)菌球菌(coccus)單球菌雙球菌四聯(lián)球菌八疊球菌葡萄球菌鏈球菌Arrangement of Spherical Bacterial Cellsdiplococci streptococci tetracocci sarcinae staphylococci .單球菌（顯微鏡下示意圖）單球菌(single coccus).雙球菌（顯微鏡下示意圖）雙球菌(double coccus)Micrococcus aerobic, gram-p

12、ositive, cell arranges mainly in pairs, or irregular clusters. They are often yellow, orange or red in colour 上：顯微鏡效果 下：電 鏡 照 片 四聯(lián)球菌(Micrococcus lactis)八疊球菌(Sarcina ureae)八疊球菌（顯微鏡下示意圖） 葡萄球菌左：電鏡照片右：顯微鏡下的金黃色葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Staphylococcus - facultatively anaerobic, gram-positive, usually

13、 form irregular clusters, nonmotile, catalase positive but oxidase negative, ferment glucose anaerobically.staphylococcistaphylococci鏈球菌鏈球菌（顯微鏡下示意圖）鏈球菌（電鏡照片）Streptococcus - facultatively anaerobic or microaerophilic, catalase negative, gram-positive, Cell arranges in pairs or chains, usually nonmoti

14、le, A few species are anaerobic rather than facultative. 電子顯微鏡下的結(jié)核菌 （綠色的就是結(jié)核桿菌）桿菌動(dòng)物宿主細(xì)胞感染桿菌瀕臨死亡 電鏡照片鏈桿菌鏈顯微鏡下的鏈桿菌螺旋菌（Spirlla) 弧菌 (vibrio) 螺菌（spirllum） 螺旋體(spirochaeta)Vibrio, Spirillum and Spirochetevibriospirillumspirochete顯微鏡下的螺旋菌 幽門螺旋菌左：顯微數(shù)碼攝像右：結(jié)構(gòu)示意圖放線菌的分布與生活方式放線菌一般分布在含量較低；有機(jī)物豐富和呈微生物堿性的土壤中。 107個(gè)g左

15、右能看到：北方春季深層黑土 地的白絲能聞到：泥土特有的“泥腥味”Chain of conidiosporesAgar surfaceSubstrate myceliumAerial hyphaeVarious types of spore-bearing structures on the streptomyces放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（模式圖）氣生菌絲孢子絲分生孢子基內(nèi)菌絲固體基質(zhì)基內(nèi)菌絲（Substrate mycelium) 又稱營養(yǎng)菌絲，功能是吸收營養(yǎng)，直徑 0.2-1.2um長度100600um，色素可有可無。基內(nèi)菌絲放線菌氣生菌絲（Aerial mycelium) 基內(nèi)菌絲長到一定時(shí)期，

16、長出培養(yǎng)基外，伸向空間的菌絲，直徑11.4um, 長短不一，形狀不一，顏色較深。 氣生菌絲 孢子絲(Reproductive mycelium) 當(dāng)氣生菌絲生長發(fā)育到一定階段，氣生菌絲上分化出的可形成孢子的菌絲。 孢子的形狀及在氣生菌絲上排列的方式隨種而異。Various types of spore-bearing structures on the streptomyces放線菌孢子絲類型直形彎曲叢生成束單輪生無螺旋 開環(huán)鉤形原始螺旋形松螺旋 緊螺旋螺旋單輪生無螺旋兩級(jí)輪生螺旋兩級(jí)輪生放線菌的菌落形態(tài)菌落質(zhì)地硬而且致密，菌落小而不廣泛延伸菌落表面呈緊密的絨狀或堅(jiān)實(shí)、干燥多皺。接種針難以挑取

17、，有時(shí)可挑碎，有時(shí)可將整個(gè)菌落挑起。2、古生菌細(xì)菌電子顯微鏡照片3、原核生物的細(xì)胞大小普通光學(xué)顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)細(xì)菌大小細(xì)菌細(xì)胞的大小細(xì)胞的大小是細(xì)菌分類特征不同細(xì)菌細(xì)胞大小不同同一細(xì)菌的不同菌齡細(xì)胞大小不同細(xì)菌細(xì)胞大小還與營養(yǎng)等因素相關(guān)細(xì)胞大小的測(cè)量結(jié)果只是近似值或平均值二、真菌 霉菌 酵母菌 FungiFilamentous fungi2. Unicellular fungi1、霉菌霉菌即絲狀真菌，有分枝與不分枝、無隔菌絲（根霉、毛霉）與有隔菌絲（青霉、曲霉）之分。 菌絲體：由許多菌絲交織在一起而組成。 在固體培養(yǎng)基上，真菌菌絲可分為：營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和繁殖菌絲。 霉菌霉菌在發(fā)酵工業(yè)上廣

18、泛用來生產(chǎn)酒精、抗生素（青霉素、灰黃霉素）、有機(jī)酸（檸檬酸、葡萄糖酸）、維生素等。在農(nóng)業(yè)上用于飼料發(fā)酵、植物生長激素（赤霉素）、殺蟲農(nóng)藥（白僵菌劑）等。另外，霉菌也是造成物品霉變的主要原因。 Sporangiospore Sporangiospores are formed within a sporangium ConidiosporesConidiospores are arranged in chains at the end of a conidiophore Conidiospores2、酵母菌 酵母菌是一群以芽殖或裂殖來進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真菌，以此與霉菌相區(qū)別。極少數(shù)種可產(chǎn)生子囊孢子進(jìn)行有性繁殖。 酵母菌在釀造、食品、醫(yī)藥工業(yè)等方面占有重要地位。酵母菌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高達(dá)細(xì)胞干重的50%以上，并含有人體必需的氨基酸，所以酵母菌可以成為食品和飼料的重要補(bǔ)充。腐生