lab-sop pcr xm007人乳頭瘤病毒6,11型核酸檢測操作熒光探針法

1、人瘤6,11型核酸檢測標準操作規(guī)程（PCR熒光探針法）1.目的：規(guī)范人瘤(HPV)6,11型核酸檢測操作流程，保證檢測結(jié)果的準確性。2.應(yīng)用范圍：PCR。3.職責：3.1文件編寫：技術(shù)員。3.2文件審核：主管。3.3文件：。3.4執(zhí)行：PCR所有。4. 參考文獻：4.1中山大學(xué)人瘤（6,11型）核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光法）說明書4.2中山大學(xué)DA7600核酸序列檢測系統(tǒng)用戶手冊5. 內(nèi)容：5.1 檢測方法：PCR-熒光探針法。5.2 實驗原理：采用一對特異性引物和一條特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR體外擴增法，即

2、高溫變性、低溫退火、適溫延伸進行DNA擴增，并對PCR全過程進行實時監(jiān)測，從而定量檢測人瘤（HPV）6,11型DNA。5.3 性能參數(shù)：5.3.1 檢測下限： 5.0102拷貝/ml。5.3.2 線性范圍：5.01025.0108拷貝/ml。5.4 標本：由合作按照以下要求進行。5.4.1 標本類型：泌尿生殖道物棉拭子、生殖道刮片、組織活檢標本等。5.4.1.1物：用細小棉拭子約24厘米，捻動拭子物，將棉拭子置于無菌試管中，密封送檢（物前2小時禁小便）。5.4.1.2 女性生殖道物：用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外物，再用宮頸刷或無菌棉拭子宮頸內(nèi)，停5秒后旋動宮頸刷或棉拭子宮頸物，將宮頸刷或棉拭子

3、置于無菌試管中，密封送檢。5.4.1.3 女性物：用無菌生理鹽水棉球洗凈口，再用無菌棉拭子約2厘米，捻動拭子物，將棉拭子置于無菌試管中，密封送檢。5.4.1.4 生殖道刮片：用刮片刮取宮頸病灶處脫落細胞，置于無菌玻璃管中，密封送檢。5.4.1.5 組織活檢標本（包括宮頸組織、組織、疣狀組織等）：取可疑組織適量置于無菌玻璃管中，密封送檢。5.4.2 標本保存：標本后保存于28。5.4.3 運送條件：標本運送采用冰壺。5.5 設(shè)備和試劑：5.5.1 設(shè)備： DA7600熒光定量PCR儀、低速水平離心機、生物安全柜、臺式高速離心機、移液器、混勻器、恒溫水浴箱/干式恒溫器、冰箱（4、-20）、移動/固

4、定紫外燈、冷凍離心機。5.5.2 試劑：5.5.2.1試劑品牌：中山大學(xué)結(jié)結(jié)核分支桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒5.5.2.2試劑批準文號：國藥準字 S20060097。5.5.2.3試劑組成：DNA 提取液（500L/管）2 管；（HPV） 6,11-PCR 反應(yīng)管（未貼）20人份；（HPV ）6,11陽性質(zhì)控品（50L/管）1 管；質(zhì)控品（500L/管）1 管。5.5.2.4 試劑包裝規(guī)格：單管單人份，20人份/盒。5.5.2.5 試劑保存和有效期：保存于-20；有效期6個月。5.6 操作過程：5.6.1 標本的處理：5.6.1.1打開恒溫水浴槽或加熱器，設(shè)定溫度 100。5.6.1

5、.2從試劑盒中取出DNA提取液，讓其在室溫下完全融化。5.6.1.3泌尿生殖道物棉拭子的處理：5.6.1.3.1向無菌試管中加入1ml滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻，擠干棉拭子。5.6.1.3.2吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，12,000rpm離心5min。5.6.1.3.3去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混勻，100恒溫處理101min。5.6.1.3.412,000rpm離心5min，待用。5.6.1.4 生殖道刮片的處理：5.6.1.4.1 向無菌試管中加入1ml滅菌生理鹽水，充分振蕩混勻。5.6.1.4.2 吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml EP管中，12,000rpm離心5

6、min。5.6.1.4.3 其余步驟同泌尿生殖道分泌物棉拭子處理的3、4步驟。5.6.1.5 組織活檢標本的處理：5.6.1.5.1 用適量滅菌生理鹽水送檢組織沾帶的血液。5.6.1.5.2 取約50毫克組織置于干凈器皿中，加1ml滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，12,000rpm離心5min。5.6.1.5.3 去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混勻，100恒溫處理101min。5.6.1.5.4 12,000rpm離心5min，備用。5.6.2 排版：在DA7600熒光定量擴增儀的上機面板表里設(shè)置面板。5.6.3 加樣： 從-20冰箱取出HPV 6,

7、11-PCR 反應(yīng)管若干管轉(zhuǎn)移至加樣區(qū)，根據(jù)上機面板的位置放好后，直接加入處理好的樣本DNA 5L，2,500rpm 離心1 min。5.6.4 DA7600熒光定量擴增儀的設(shè)置及結(jié)果分析：參見PCR擴增檢測及結(jié)果分析操作規(guī)程。5.6.5實驗數(shù)據(jù)。5.6.6 取出結(jié)束后擴增儀內(nèi)擴增產(chǎn)物需用手套包好、后，丟入醫(yī)療廢物桶內(nèi)，以防止擴增管破裂而導(dǎo)致污染。5.6.7 關(guān)閉擴增儀電源和計算機電源。5.7 臨床意義：直接反映內(nèi)人瘤（HPV）6,11型是否存在及其活躍程度，可作人乳頭瘤（HPV）6,11型的輔助及其療效監(jiān)測的標準。5.8 安全防護措施：5.8.1 試劑處理：5.8.1.1使用或更換試劑時，務(wù)

8、必戴手套；不要用身體直接接觸試劑，以免損傷皮膚。5.8.1.2如果皮膚接觸了試劑，立即用大量清水沖洗并。5.8.1.3如果眼睛接觸了試劑，立即用噴淋器沖洗，并緊急就醫(yī)。5.8.2 儀器使用：5.8.2.1儀器運轉(zhuǎn)中不要觸摸加樣機構(gòu)、試劑分注機構(gòu)、攪拌機構(gòu)、反應(yīng)容器機構(gòu)等可動部分。5.8.2.2 儀器通電時不能打開儀器上面、背面、側(cè)面的蓋板，不能觸摸光源燈的玻璃面。5.8.3 生物安全防護：參見生物安全防護手冊。5.9 注意事項：5.9.1PCR熒光定量檢測法比較容易受污染，所以實驗過程中應(yīng)避免反復(fù)開蓋，所用耗材均需高壓滅菌。5.9.2試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。5.9.3試劑盒DNA提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。6.相關(guān)表格：6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001PCR實驗、交表6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001PCR遲發(fā)登記表6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001PCR不