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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。siRNA對腫瘤抑制蛋白基因P53的siRNA設(shè)計TOCo1-3hzuHYPERLINKl_Toc388816874摘要PAGEREF_Toc388816874h3HYPERLINKl_Toc388816875前言PAGEREF_Toc388816875h3HYPERLINKl_Toc388816876一、siRNA作用機制PAGEREF_Toc388816876h3HYPERLINKl_Toc388816877二、siRNA設(shè)計原理與規(guī)則PAGEREF_Toc388816877h3HYPERLINKl

2、_Toc3888168781、siRNA反義鏈5末端堿基設(shè)計、siRNA正義鏈設(shè)計、G/C比例PAGEREF_Toc388816878h3HYPERLINKl_Toc3888168792、siRNA目的位置二級結(jié)構(gòu)預測提高siRNA效率PAGEREF_Toc388816879h4HYPERLINKl_Toc3888168803、內(nèi)部重復序列PAGEREF_Toc388816880h4HYPERLINKl_Toc388816881三、對P53的siRNA設(shè)計過程PAGEREF_Toc388816881h4HYPERLINKl_Toc3888168821、設(shè)計大致步驟PAGEREF_Toc3888

3、16882h4HYPERLINKl_Toc3888168832、在GenBank數(shù)據(jù)庫獲取P53序列PAGEREF_Toc388816883h4HYPERLINKl_Toc3888168843、兩種軟件上的設(shè)計PAGEREF_Toc388816884h5HYPERLINKl_Toc388816885參考文獻PAGEREF_Toc388816885h8摘要：siRNA干擾技術(shù)作為一種新型的基因沉默技術(shù)，因其具有高校、高特異性、低毒性等優(yōu)點，應用siRNA干擾技術(shù)開發(fā)新型的靶向藥物，已成為藥物研究領(lǐng)域中重點發(fā)展方向之一。因此，了解siRNA干擾技術(shù)對未來藥物領(lǐng)域?qū)W習有至關(guān)重要的作用。本文是利用NC

4、BI的基因庫(GeneBank)及兩種計算機輔助設(shè)計軟件對腫瘤抑制蛋白基因P53進行siRNA設(shè)計，并對方法和結(jié)果進行分析比對。前言：RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導的、在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應基因表達的過程。其中siRNA是RNAi發(fā)揮效應所必需的因子，因此掌握siRNA實驗和設(shè)計方法非常重要。關(guān)于設(shè)計siRNA目前尚無可靠的規(guī)律，不過，不少實驗室和科研機構(gòu)都開發(fā)了相應的HYPERLINK/zhuanti/product/201308/443437.htmlsiRNA設(shè)計軟件。設(shè)計HYPERLINK/zt/rna/rna.htmlsiRNA設(shè)計是一個需要由軟件完成的工作，接下來，

5、我將用這兩種軟件對腫瘤抑制蛋白基因P53進行siRNA設(shè)計，并進行分析。一、siRNA作用機制小干擾RNA作為與RNA干擾現(xiàn)象緊密相連的非編碼RNA之一，是后基因組時代的重要研究工具。其作用機制首先是進入體內(nèi)的siRNA雙鏈解開，引導鏈（指siRNA反義鏈）進入RNA介導的沉默復合體（RISC），并切斷具有序列特異性的mRNA，切斷部位大約在與反義鏈配對序列的中部，然后靶mRNA進一步降解。二、siRNA設(shè)計原理與規(guī)則RNAi作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)。不同的siRNA序列沉默基因的效率差別很大。因此，理性設(shè)計有效siRNA就成為試驗成功的一個關(guān)鍵因素。借助生物信息學手段以選

6、擇最佳siRNA，可使用一些篩選模型優(yōu)化寡核苷酸序列性質(zhì)，諸如G/C比例，堿基變化以及序列中重復堿基數(shù)目。1、siRNA反義鏈5末端堿基設(shè)計、siRNA正義鏈設(shè)計、G/C比例目前,siRNA的設(shè)計有兩種方法一種以有效序列為依據(jù)并應用統(tǒng)計學計算獲得的設(shè)計規(guī)律。ReynoldsA等針對2個基因合成了180條siRNA,，通過測定其沉默效率，總結(jié)出理性設(shè)計有效siRNA的8條原則:：1）GC含量在30%55%之間；2）有義鏈1519位至少有3個A或U；3）避免出現(xiàn)倒置重復，會形成發(fā)卡；4)有義鏈19位為A；5）有義鏈3位為A；6）有義鏈10位為U；7）有義鏈19位非G或C；8）有義鏈13位非G。該原

7、則已經(jīng)被普遍應用于siRNA的序列設(shè)計。另一種方法是以siRNA序列上的能量為依據(jù)，篩選可能的有效序列ChalkAM等通過收集文獻發(fā)表的針對92個基因的有效的siRNA398條，應用氫鍵的能量分布規(guī)律進行分析，提出:1）總的siRNA雙鏈能量1；2）反義鏈5端的結(jié)合能小于9；3）有義鏈5端結(jié)合能在59之間；4）GC含量在3653%之間；5）中間（712）的結(jié)合能小于13；6）反義鏈5端與正義鏈5端的能量差小于0；7）反義鏈5端與正義鏈5端的能量差最好在10之間。2、siRNA目的位置二級結(jié)構(gòu)預測提高siRNA效率siRNA雙鏈末端不同熱力學穩(wěn)定性，提示哪條鏈會進入RISC中。雙鏈末端穩(wěn)定性對于

8、沉默效果預測影響占60，二級結(jié)構(gòu)預測可改善siRNA位點預測效率，80的非作用位點可以通過二級結(jié)構(gòu)預測來排除。3、內(nèi)部重復序列因包含內(nèi)部重復序列或回文序列的siRNA可能形成潛在內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)或折疊結(jié)構(gòu)，降低了siRNA有效濃度及沉默效力，故siRNA設(shè)計時應避免內(nèi)部重復序列。三、對P53的siRNA設(shè)計過程1、設(shè)計大致步驟首先，從靶cDNA啟動密碼子下游50100bp處開始選擇siRNA作用位點。5和37非編碼區(qū)和啟始密碼子附近區(qū)域應盡量避兜一固為這些區(qū)域或是編碼調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點、非編碼區(qū)結(jié)合蛋白或翻譯啟始復合物的區(qū)域它們可能對RISC復合物的形成造成干擾，而削弱RNAi的作用。找出啟始密碼子

9、下游的AA，將連同其后(N19)TT記錄下來，即AA(N19)TT，計算這23hp中G和C堿基含量，最好在50左右(3055%之間)。假若堿基序列和G、C臺量達不到上進要求，也可找AA牙頭的21bp，即AA(N21)寡核苷酸。正義鏈siRNA序列相應就成為(N19)rIr或N21。對于后一種情況，在正義鏈sirNA序列的3末端加上TT，目的在于確保雙鏈的對稱性，使合成出的dsRNA正義、反義鏈具有3端突出；最后在NCBl和EST數(shù)據(jù)庫查找并確定所設(shè)計的靶基曰是唯一的。2、在GenBank數(shù)據(jù)庫獲取P53序列cgtgctttccacgacggtgacacgcttccctggattggccagac

10、tgccttccgggtcactgccatggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtc

11、atcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatct

12、tatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcatgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaagggga

13、gcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgtccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagactg

14、acattctccacttcttgttccccactgacagcctcccacccccatctctccctcccctgccattttgggttttgggtctttgaacccttgcttgcaataggtgtgcgtcagaagcacccaggacttccatttgctttgtcccggggctccactgaacaagttggcctgcactggtgttttgttgtggggaggaggatggggagtaggacataccagcttagattttaaggtttttactgtgagggatgtttgggagatgtaagaaatgttcttgcagttaagggttagtttacaatcagc

15、cacattctaggtaggggcccacttcaccgtactaaccagggaagctgtccctcactgttgaattttctctaacttcaaggcccatatctgtgaaatgctggcatttgcacctacctcacagagtgcattgtgagggttaatgaaataatgtacatctggccttgaaaccaccttttattacatggggtctagaacttgacccccttgagggtgcttgttccctctccctgttggtcggtgggttggtagtttctacagttgggcagctggttaggtagagggagttgtcaagtctctgct

16、ggcccagccaaaccctgtctgacaacctcttggtgaaccttagtacctaaaaggaaatctcaccccatcccacaccctggaggatttcatctcttgtatatgatgatctggatccaccaagacttgttttatgctcagggtcaatttcttttttctttttttttttttttttctttttctttgagactgggtctcgctttgttgcccaggctggagtggagtggcgtgatcttggcttactgcagcctttgcctccccggctcgagcagtcctgcctcagcctccggagtagctgggacc

17、acaggttcatgccaccatggccagccaacttttgcatgttttgtagagatggggtctcacagtgttgcccaggctggtctcaaactcctgggctcaggcgatccacctgtctcagcctcccagagtgctgggattacaattgtgagccaccacgtccagctggaagggtcaacatcttttacattctgcaagcacatctgcattttcaccccacccttcccctccttctccctttttatatcccatttttatatcgatctcttattttacaataaaactttgctgccaaaaaaaaaaaaa

18、aaaaaaa3、兩種軟件上的設(shè)計（1）金斯瑞GenScript(圖片1，以上圖片為在金斯瑞軟件中選擇目標參數(shù)的圖片)siRNAcandidatetargetsafterHomologyfiltering:窗體頂端No.SequenceStartGC%HYPERLINK/ssl-bin/app/rnai#ScoresE/ThermodynamicSNPsHYPERLINK/ssl-bin/app/rnai#Off-targetPos-Motifs1.AAGCGAGCACTGTCCAACAAC97852.3820.003.73/-37.60NAHYPERLINK/temp/rnai1401013

19、529416/offtarget0.html0/4602.AAGAGAATCTCCGCAAGAAAG92242.8619.173.17/-33.40NAHYPERLINK/temp/rnai1401013529416/offtarget1.html0/4603.AATGCTGGCATTTGCACCTAC164047.626.922.87/-36.20NAHYPERLINK/temp/rnai1401013529416/offtarget2.html0/4604.AATTTGCGTGTGGAGTATTTG66338.10-1.022.82/-30.70NAHYPERLINK/temp/rnai1

20、401013529416/offtarget3.html0/460（表格1，以上表格為通過金斯瑞GenScript設(shè)計的siRNA）GenScript會根據(jù)我們的要求找到siRNA靶位點，得到候選序列。候選序列通過BLAST/SmithWaterman將被過濾，以除去非唯一的序列與一個唯一的和全面的EST/mRNA的集合。siRNA的候選人的排名是基于使用E參數(shù)的一種特有算法。在篩選的條件中包括GC的范圍、雙鏈、研究物種、研究器官、目標基因序列的大小、序列的排序等，細致的篩選條件有利于我們精確的篩選出目的siRNA，本軟件一個很好的地方還包括可以自動利用blast軟件對選擇的靶序列比對進行同源

21、性分析，排除siRNA非特異性抑制其它基因的可能性，對我們這些基礎(chǔ)操作者極其便利。另外，得出的結(jié)果中包括基因序列、siRNA在源基因中的起始位置、GC比例、分數(shù)、熱力學等，這些可以讓我們優(yōu)先選取適合的siRNA。siRNAatWHITEHEAD（圖片2，以上圖片為在siRNAatWHITEHEAD軟件中選擇目標參數(shù)的圖片）（圖片3，圖片3為為通過siRNAatWHITEHEAD軟件設(shè)計的siRNA）siRNAatWHITEHEAD軟件包括的設(shè)置參數(shù)有基因序列、siRNA模式、GC比例、排除一行中更多的A、T、排除一行中更多的G、siRNA的堿基等，本軟件需要手動利用blast軟件對選擇的靶序列比對進行同源性分析，排除siRNA非特異性抑制其它基因的可能性，siRNA的模式有三種，分別是A=AAN19TT；B=NAN19NN；C=N2CGN8AUN8AUN2；得出的siRNA模式列于表格中，用這種軟件得出的結(jié)果內(nèi)容包括siRNA序列在源基因序列中的整體位置，siRNA兩條鏈的序列以及mRNA序列，熱力學范圍。相對于金斯瑞軟件，本軟