高效毛細管電泳

1、高效毛細管電泳 Capillary Electrophoresis復旦大學 化學教學實驗中心雷 杰一、電 泳(eletrophoresis)：帶電粒子在電場中的定向移動。1937年，瑞典科學家Tiselius設計了世界上第一臺電泳儀，建立了移界電泳法，并于1948年榮獲諾貝爾獎。多年以來，電泳技術(shù)圍繞制膠、電泳、染色三個技術(shù)環(huán)節(jié)，不斷改進，以實現(xiàn)下列目標： 1、提高分辨率及靈敏度。 2、簡化操作，縮短電泳時間。 3、擴大應用范圍。各類電泳技術(shù)已廣泛應用于生命科學各個領域。二、毛細管電泳(Capillary Electrophoresis)毛細管電泳(CE)又稱高效毛細管電泳(HPCE)，是指離

2、子或帶電粒子以毛細管為分離介質(zhì)，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的液相分離分析技術(shù)。由于毛細管內(nèi)徑小，表面積和體積的比值大，易于散熱，因此毛細管電泳可以減少焦耳熱的產(chǎn)生，這是CE和傳統(tǒng)電泳技術(shù)的根本區(qū)別。采用了0.05 mm內(nèi)徑的毛細管；采用了高達數(shù)千伏的電壓。（一） 基本概念毛細管有效長度 (l, cm) 毛細管的入口端到檢測窗口的距離； 遷移時間 (t, min) 帶電粒子在電場作用下做定向移動的時間；電泳速度（v cm/s） 在單位時間內(nèi)，帶電粒子定向移動的距離；電場強度(E, V/cm) 電場強度/毛細管總長度；電泳淌度（m cm2/(Vs)

3、 ）帶電粒子在毛細管中定向移動的速度與所在電場強度之比；三、毛細管電泳基本原理毛細管總長度 (L, cm)毛細管 (內(nèi)徑50 mm , 外徑375 mm )毛細管全長（L）入口到檢測窗總長（l） 當固體與液體接觸時，固體表面帶一種電荷，因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層。 當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。 （二）電滲現(xiàn)象與電滲流 （electroosmosis and electroosmotic flow） 毛細管電泳中，溶液整體移

4、動，電滲流的流動為平流，塞式流動，譜帶展寬很?。?液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍，引起譜帶展寬較大。 石英毛細管柱，內(nèi)充液pH 3時，表面電離成-SiO-，管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層后，電滲流方向為由正極到負極。 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的57倍； 各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為： + =電滲流 + +ef 陽離子運動方向與電滲流一致； - =電滲流 - -ef 陰離子運動方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效

5、率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO+-Na+Cl-電滲電泳電泳 遷移速度Na+Cl-矢量速度合速度 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；（三）影響電滲流的因素2.毛細管材料的影響 1.電場強度的影響（1）溶液pH的影響 對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大； pH3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。

6、分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響 毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”； 焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量； CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。 溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%3%；4.溫度的影響 （1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液

7、的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向； 加入不同陽離子表面活性劑可控制電滲流。 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流減小。5.添加劑的影響 色譜過程熱力學Detector ResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)t = 保留時間 t = 死時間R W = 峰底寬度0tR(B) - tR(A)WA + WBR = 2tR(B) - tR(A)W1/2A + W1/2B = 1.176K=tR-t0t0容量因子分離度 定性和定

8、量：保留時間和峰面積（峰高）（四）色譜參數(shù)色譜過程動力學 之 塔板理論塔板高度 HL/n理論塔板數(shù)tR為樣品的保留時間；Wb為峰底寬；tR為調(diào)整保留時間；L色譜柱長度。四、毛細管電泳儀器（一）進樣系統(tǒng) 進樣量：進樣長度必須控制在毛細管總長度的1%2%，否則將影響分離效率；納升級；1. 流體力學進樣方式 （1）進樣端加壓 （2）出口端抽真空 （3）虹吸進樣 毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2. 電動進樣方式進樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；特別適合黏度大的試樣3. 擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱端口處。（二）分離系統(tǒng)高壓電

9、源（1）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；電源極性易轉(zhuǎn)換；毛細管柱 （1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075 mm，外徑350400 mm；長度1 m（三）檢測系統(tǒng)常用的檢測方式是紫外-可見光吸收。檢測器位于距進樣端約毛細管總長的2/34/5處；此外，電化學、熒光、激光誘導熒光、質(zhì)譜等檢測方法也被應用于毛細管電泳;優(yōu)勢互補。TriSepTM-2010GV pCEC System五、毛細管電泳分離模式毛細管區(qū)帶電泳 (Capillary Zone Electrophoresis，CZE)毛細管膠束電動色譜 (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MEKC，MECC)毛細管凝膠電泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）毛細