糞便標(biāo)本中致病菌的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)材料

1、臨床模擬標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)書1.標(biāo)本分析標(biāo)本中可能的正常菌群：正常情況下腸道中有多種細(xì)菌寄生，包括大量的厭氧菌、腸球菌、大腸埃希菌、腸桿菌、變形桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌等。標(biāo)本中可能存在的病原菌：細(xì)菌性：吸收不良性腹瀉，包括致病性大腸埃希菌等；產(chǎn)毒素性腹瀉，包括霍亂弧菌、腸毒素型大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌、變形桿菌、氣單胞菌屬、蠟樣芽胞桿菌等；侵襲性腹瀉，包括志賀菌、腸致病型大腸埃希菌、腸侵襲型大腸埃希菌、腸出血型大腸埃希菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等；食物中毒，包括沙門菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、乙型溶血鏈球菌和肉毒梭菌等；偽膜性腸炎，包括艱難梭菌或金黃色葡萄球菌；慢性腹

2、瀉，可能由結(jié)核桿菌引起；繼發(fā)性腸道感染：銅綠假單胞菌、非結(jié)核分枝桿菌等。真菌性：念珠菌、毛霉菌等。病毒性：輪狀病毒等。檢驗(yàn)思路 圖1-1 糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序3.擬采用的實(shí)驗(yàn)方法及預(yù)期結(jié)果（1）顯微鏡檢查（僅在懷疑為霍亂弧菌、艱難梭菌、結(jié)核分枝桿菌感染等情況下進(jìn)行）不染色標(biāo)本檢查：用生理鹽水或盧戈氏碘液或0.1%亞甲藍(lán)染液與等量的糞便標(biāo)本混合均勻涂于載玻片上，蓋上蓋玻片用相差顯微鏡或暗視野顯微鏡高倍鏡鏡檢。A.若標(biāo)本呈米泔樣或洗肉水樣，鏡檢發(fā)現(xiàn)逗點(diǎn)狀或彎曲狀的弧菌，呈流星樣穿梭，運(yùn)動(dòng)活潑，提示霍亂弧菌感染。此時(shí)加入O群或O139群霍亂弧菌多價(jià)診斷血清，顯微鏡下觀察與不加診斷血清比較，若大于8

3、0%的細(xì)菌停止運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)明顯減弱，判斷為制動(dòng)試驗(yàn)陽性，可初步報(bào)告為“疑似O群或O139群霍亂弧菌”。B.若發(fā)現(xiàn)呈S形、螺旋形并快速、擰塞樣或投鏢樣運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，提示為彎曲菌。C.若高倍鏡觀察發(fā)現(xiàn)有無光亮的卵圓形孢子或假菌絲可初步報(bào)告酵母樣真菌感染。染色檢查：如細(xì)菌染色呈現(xiàn)下列典型形態(tài)時(shí)，對(duì)診斷具有提示作用。A.取新鮮米泔樣類便標(biāo)本涂片2張，用乙醇或甲醇固定，分別進(jìn)行革蘭染色和1：10稀釋苯酚復(fù)紅染色，油鏡觀察呈魚群狀排列的桿狀或弧形紅色革蘭陰性桿菌。提示為霍亂弧菌。B.糞便做革蘭染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)小、長而彎曲，呈S形或螺旋形、海鷗狀的革蘭陰性弧菌，可初步報(bào)告“疑似空腸彎曲菌”。C.取水樣便涂片，革

4、蘭染色，若發(fā)現(xiàn)大量散在或成堆（葡萄狀）排列的革蘭陽性球菌同時(shí)伴隨革蘭陰性桿菌明顯減少，疑為引起偽膜性腸炎的葡萄球菌。D.抗生素相關(guān)性腹瀉的主要病原菌，大便呈黃綠色糊狀便或暗綠色海水樣便，黏液多，有時(shí)可見片狀偽膜，涂片革蘭染色可見大量革蘭陽性粗大桿菌、無莢膜、卵圓形芽胞位于菌體一端同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞疑為艱難梭菌。E.涂片革蘭染色見瓜子狀革蘭陽性孢子或假菌絲，可初步報(bào)告檢出酵母樣真菌。F.取蠶豆大小小的糞便與飽和生理鹽水10ml混合，靜置1小時(shí)，取表面液體涂片進(jìn)行抗酸染色，發(fā)現(xiàn)紅色抗酸桿可報(bào)告“找到抗酸桿菌”，提示為結(jié)核分枝桿菌。（2）培養(yǎng)與鑒定 標(biāo)本用分區(qū)劃線法接種于普通瓊脂平板、SS、麥康凱、血

5、平板等培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h，觀察生長情況。革蘭陽性菌的分離培養(yǎng)與鑒定A.球菌，葡萄狀排列，在普通平板上形成金黃色菌落，在血平板上形成圓形凸起、光滑，呈金黃色或橙色菌落，有透明溶血環(huán)。觸酶試驗(yàn)陽性，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽性：可判斷為金黃色葡萄球菌。B.球菌，成對(duì)或短鏈狀排列。菌落光滑、灰白色、圓形凸起，可呈現(xiàn)不同的溶血現(xiàn)象。觸酶試驗(yàn)陰性，膽汁七葉苷試驗(yàn)陽性：可判斷為腸球菌。C.球形或橢圓形，鏈狀排列。在血平板上可形成灰白色細(xì)小菌落，觸酶試驗(yàn)陰性，桿菌肽敏感試驗(yàn)陽性，膽汁七葉苷試驗(yàn)陰性：可判斷為乙型溶血鏈球菌。革蘭陰性菌的分離培養(yǎng)與鑒定A.直

6、或彎曲桿菌，在普通瓊脂平板上產(chǎn)生水溶性綠膿素，使整個(gè)培養(yǎng)基變?yōu)榫G色，氧化酶試驗(yàn)陽性：可判斷為銅綠假單胞菌。B.粗短桿菌，在普通瓊脂平板上形成大而濕潤的黏液狀菌落，血平板上不溶血，在MAC上呈粉紅色或紅色菌落，SS上粉紅色菌落。氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，MIU：+-，硝酸鹽試驗(yàn)陽性：可判斷為產(chǎn)氣腸桿菌。C.桿菌，MAC上無色透明，SS上無色透明，氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陽性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽試驗(yàn)陽性：可判斷為摩根菌。D.在MAC平板上粉紅色，在SS上為粉紅色或中央為粉紅色、周圍無色的菌落。氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試

7、驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，KIA試驗(yàn)：A/A產(chǎn)氣，MIU試驗(yàn)：+-（動(dòng)力試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，脲酶試驗(yàn)陰性），糖類發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMVC試驗(yàn)：+-（吲哚試驗(yàn)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性，VP試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性），硫化氫試驗(yàn)陰性，O-F試驗(yàn)為發(fā)酵型：可判斷為大腸埃希菌。E.MAC上無色不透明，SS上無色不透明或透明。氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，KIA試驗(yàn)：K/A，MIU試驗(yàn)：-V-（動(dòng)力試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)不定，脲酶試驗(yàn)陰性），IMVC試驗(yàn)：V+-（吲哚試驗(yàn)不定，甲基紅試驗(yàn)

8、陽性，VP試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性），硫化氫試驗(yàn)陰性，血清學(xué)分型鑒定陰性：可判斷為痢疾桿菌。F.在SS上中央為黑色不透明或透明、無色的菌落，MAC上較小，無色透明。氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，KIA試驗(yàn)：K/A，MIU試驗(yàn)：+-（動(dòng)力試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陰性，脲酶試驗(yàn)陰性），IMVC試驗(yàn)：-+-+（吲哚試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陽性，VP試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陽性），硫化氫試驗(yàn)陽性，血清學(xué)分型鑒定陽性：可判斷為沙門菌。G.在SS培養(yǎng)基上的菌落中有黑點(diǎn)，普通瓊脂平板上可見遷徙現(xiàn)象，氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，苯丙氨酸脫氨酶試

9、驗(yàn)陽性，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)陰性，脲酶陽性的可判斷為變形桿菌。真菌的分離培養(yǎng)與鑒定 A.將標(biāo)本用分區(qū)劃線法接種于科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，置35培養(yǎng)1824h。形成紫色菌落的是近平滑念珠菌，形成綠色菌落的是白念珠菌。4.所需器材及試劑實(shí)驗(yàn)器材：酒精燈、顯微鏡、載玻片、鑷子、濾紙條、接種針、接種環(huán)、移液槍、37培養(yǎng)箱、香柏油、擦鏡紙。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：糞便標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)試劑：平板：SS平板、麥康凱平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、石炭酸平板。試劑：革蘭染色液、生理鹽水；觸酶實(shí)驗(yàn)：3%過氧化氫溶液；氧化酶試驗(yàn)：氧化酶試劑；苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)：苯丙氨酸培養(yǎng)基；KIA斜面培養(yǎng)基；MIU培養(yǎng)基、吲哚試劑；氨基酸脫羧酶試驗(yàn)：氨

10、基酸培養(yǎng)基、對(duì)照培養(yǎng)基、無菌液體石蠟；硝酸鹽還原試驗(yàn)：硝酸鹽還原培養(yǎng)基、硝酸鹽還原劑（甲液和乙液）；O-F試驗(yàn)：葡萄糖氧化發(fā)酵管。5.實(shí)驗(yàn)進(jìn)度安排第一天：進(jìn)行顯微鏡檢查和倒平板，觀察待測(cè)菌革蘭染色鏡下圖并分析為革蘭陰性菌還是革蘭陽性菌，然后將標(biāo)本用分區(qū)劃線法接種于SS平板和MAC平板，置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h。第二天：觀察MAC和SS平板上菌落特征，分別挑取不同單菌落進(jìn)行革蘭染色再次確認(rèn)為革蘭陰性細(xì)菌還是革蘭陽性細(xì)菌，然后分別進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、觸酶實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、KIA試驗(yàn)、MIU試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、接種普通平板與石炭酸平板等。記錄并分析各實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且分析有幾種

11、細(xì)菌存在。 第三天：分析結(jié)果，觀察普通平板上菌落情況有無發(fā)生遷徙現(xiàn)象，沒有則排除變形桿菌。分別在苯丙氨酸培養(yǎng)基中加入23滴氯化鐵溶液后，觀察有無變綠，分別觀察氨基酸脫羧酶試驗(yàn)測(cè)定管和對(duì)照管顏色變化，分別觀察KIA培養(yǎng)基斜面和底層顏色、有無產(chǎn)生氣泡、培養(yǎng)基有無變黑色，分別觀察MIU培養(yǎng)基穿刺線是否清晰、培養(yǎng)基有無變紅、加入吲哚試劑上層有無變紅，分別觀察硝酸鹽培養(yǎng)基加入硝酸鹽還原劑后有無變紅并記錄各實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后做血清學(xué)分型鑒定試驗(yàn)，鑒定細(xì)菌種類。若有兩種細(xì)菌存在，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與事實(shí)不符，分析得可能出現(xiàn)污染需重復(fù)試驗(yàn)，再次接種在SS和MAC平板上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。2021.12.9：觀察MAC和SS平

12、板上形成的單菌落的顏色形態(tài)并記錄，做重復(fù)試驗(yàn)，挑取單菌落進(jìn)行MIU試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、O-F試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析和處理，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。6.注意事項(xiàng)：（1）挑取菌落時(shí)要小心謹(jǐn)慎，防止出現(xiàn)雜菌污染，若出現(xiàn)污染應(yīng)立即重復(fù)試驗(yàn)，遵循實(shí)驗(yàn)事實(shí)，保證結(jié)果可靠性。（2）注意實(shí)驗(yàn)室消毒安全和無菌操作，細(xì)菌鑒定操作必須嚴(yán)格遵循有關(guān)制度。（2）腸道內(nèi)存在大量的正常菌群，除非為了正常菌群的調(diào)查和鑒定，一般分離可疑致病菌應(yīng)使用選擇性平板。（2）最好采集急性期和抗生素使用前的糞便標(biāo)本，進(jìn)行床邊接種。懷疑沙門菌感染時(shí)，應(yīng)在發(fā)病2周后采集。（3）除懷疑霍亂弧菌、結(jié)核分枝桿菌和菌群失調(diào)引起的腹瀉外，糞便標(biāo)本一般不做涂片檢查。在以糖類發(fā)酵為鑒別依據(jù)的培養(yǎng)基上，發(fā)酵型菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)