《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》

1、、總則GeneralPrinciple1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。儀器和設(shè)備2.1天平。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶。2.5玻璃珠。2.6玻璃棒。2.7刻度吸管。2.8研缽。2.9均質(zhì)器。2.10恒溫水浴箱。2.11采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開(kāi)罐器等。培養(yǎng)基和試劑3.1生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸餾水加至1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90mL,103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌。3.2SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g3g5g2.5g2.5g1g7g1000mL大豆蛋白胨氯

2、化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂吐溫80蒸餾水制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.27.3，分裝，103.43kPa(151b)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25C左右使用。注：如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。滅菌液體石蠟。滅菌吐溫80。樣品的采集及注意事項(xiàng)所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小于20g的樣品，采樣量應(yīng)適量增加，其總量應(yīng)大于16g。供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)，進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)

3、為市售包裝。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品被污染。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。若只有一份樣品而同時(shí)需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，應(yīng)先做微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行。供檢樣品的制備液體樣品5.1.1水溶性的液體樣品，量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。5.1.2油性液體樣品，取樣品

4、10mL，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80,在40C44C水浴中振蕩混合10min,加入滅菌的生理鹽水75mL（在40C44C水浴中預(yù)溫），在40C44C水浴中乳化，制成1:10的懸液。膏、霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1親水性的樣品，稱(chēng)取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。5.2.2疏水性樣品，稱(chēng)取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80,研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40C44C水浴中充分混合，制成1:10檢液。5.3固體樣品，稱(chēng)取

5、10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1:10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱(chēng)10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱(chēng)10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL滅菌吐溫80，70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min5min。二、菌落總數(shù)AerobicBacterialCount1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)(aerobicbacterialcount)是指化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、

6、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。儀器和設(shè)備3.1三角瓶。3.2量筒。pH計(jì)或精密pH試紙。高壓滅茵器。試管。平皿：直徑9cm?？潭任埽?0mL、2mL、1mL酒精燈。恒溫培養(yǎng)箱。放大鏡。培養(yǎng)基和試劑生理鹽水：見(jiàn)總則中3.1。卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark26 4.2.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫807g

7、蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分(除瓊脂外)加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)pH值為7.17.4,力口入瓊脂，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.30.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC)成分：TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過(guò)濾，103.43kPa（15lb）20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4C冰箱備用。操作步驟5.1用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1m

8、L注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻,制成1:100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000,1:10000,等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。5.2將融化并冷至45C50C的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi),每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，為空白對(duì)照。為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每

9、100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無(wú)變化。菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法首先選取平均菌落數(shù)在30300個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（

10、見(jiàn)表1中例1）。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見(jiàn)表1中例2及例3）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例4）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1例5）。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例6）。7.6若所有的稀釋

11、度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。7.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以?xún)?nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表1報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù)CFU/mL或CFU/g扌報(bào)告方式CFU/mL或CFU/g10-110-210-311365164201640016000或1.6X10422760295461.63800038000或3.8X10432890271602

12、.22710027000或2.7X1044不可計(jì)4650513513000510000或5.1X105527115270270或2.7X1026不可計(jì)305123050031000或3.1X10470001X1010大CFU：菌落形成單位。三、糞大腸菌群FecalColiforms1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(Fecalcoliforms)系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，在44.5C培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌來(lái)自人和溫血?jiǎng)游锛S便，是重要的衛(wèi)生指示菌。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水

13、式恒溫箱：44C0.5C。溫度計(jì)。顯微鏡。載玻片。接種環(huán)。電爐。三角瓶。試管。小倒管。pH計(jì)或pH試紙。高壓滅茵器?？潭任埽?0mL、2mL、1mL。平皿。培養(yǎng)基和試劑雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解于蒸餾水中，調(diào)pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液5mL,混勻，分裝試管(每支試管中加一個(gè)小倒管)。68.95kPa(10lb)20min滅菌。4.2伊紅美蘭(EMB)瓊脂TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂2%伊紅水溶液0.5%

14、美藍(lán)水溶液蒸餾水20g20mL13mL1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻,使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至lOOOmL。校正pH值為7.27.4,分裝于三角瓶?jī)?nèi)，103.43kPa(15lb)15min高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60C左右無(wú)菌操作加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3蛋白胨水(作靛基質(zhì)試驗(yàn)用)成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g5g1000mL氯化鈉蒸餾水制法：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.07.2，分裝小試管，103.43kPa(15lb)15min高壓滅菌。靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對(duì)二

15、甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于440.5C培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.30.5mL，輕搖試管。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買(mǎi)來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用革蘭氏染色液：染液制備結(jié)晶紫染色液：TOC o 1-5 h z結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液： HYPERLINK l bookmark80 碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至3

16、00mL。脫色液：95%乙醇。復(fù)染液：沙黃復(fù)染液：TOC o 1-5 h z沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。稀石碳酸復(fù)紅液：稱(chēng)取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100mL，放置過(guò)夜，濾紙過(guò)濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2染色法4.521將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染lmin,水洗。4.522滴加革蘭氏碘液，作用lmin,水洗。4.523滴加95%乙醇脫色，約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M(mǎn)整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，脫色10s，水洗

17、。4.5.2.4滴加復(fù)染液，復(fù)染lmin，水洗，待干，鏡檢。染色結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需10s。操作步驟5.1取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置44C0.5C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。5.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)18h24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白胨水中，置44C0.5C培養(yǎng)24h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光

18、滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。四、綠膿桿菌PseudomonasAeruginosa1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中綠膿桿菌的檢驗(yàn)。2定義本規(guī)范采用下列定義。綠膿桿菌(Pseudomonasae

19、ruginosa)屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42C條件下能生長(zhǎng)。該菌對(duì)人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3儀器3.1恒溫培養(yǎng)箱：37C、42Co3.2三角瓶。3.3試管。3.4平皿?？潭任埽?0mL、2mL、1mL。顯微鏡。載玻片。接種針、接種環(huán)。電爐。高壓滅茵器。培養(yǎng)基和試劑SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4

20、7.6，加入瓊脂，68.95kPa(10lb)20min滅菌后，制成平板備用。乙酰胺培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：乙酰胺10g氯化鈉5g無(wú)水磷酸氫二鉀1.39g無(wú)水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂(MgSO47H2O)0.5g酚紅0.012g(1.2%溶液1mL)瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油(化學(xué)純)10g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到

21、蒸餾水中，加溫使其溶解，調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68.95kPa(10lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min,隨時(shí)攪拌加溫使之溶解，調(diào)pH至7.4,分裝于試管內(nèi)，經(jīng)68.95kPa(10lb)20min滅菌后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0.5g蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過(guò)濾后補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀

22、和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95kPa(10lb)20min滅菌后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.27.4,加入瓊脂，加熱溶解,分裝試管，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆?。操作步驟5.1增菌培養(yǎng):取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)18h24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線

23、接種在十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)18h24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周?chē)囵B(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差。在缺乏十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平板上，放37C培養(yǎng)24h，綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周?chē)囵B(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌不生長(zhǎng)。染色鏡檢:挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn):取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒挑取綠膿桿菌

24、可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，在15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗(yàn)陰性。5.5綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落23個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上，置37C培養(yǎng)24h，加入氯仿3mL5mL，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽(yáng)性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn):挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)24h，觀

25、察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽(yáng)性,表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.7明膠液化試驗(yàn)，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37C培養(yǎng)24h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；如凝固不溶者為陰性。5.842C生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在4142C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h，綠膿桿菌能生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長(zhǎng)，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即

26、可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42C生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。五、金黃色葡萄球菌StaphylococcusAureus1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀排列，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽(yáng)性。該菌是葡萄球菌中對(duì)人類(lèi)致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥。儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱。3.3離心機(jī)。3.4

27、刻度吸管：1mL、5mL、10mL。3.5試管。3.6載玻片。3.7酒精燈。培養(yǎng)基和試劑SCDLP液體培養(yǎng)基見(jiàn)總則中3.2。BairdParker氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨10g5g1g10g12g5g20g950mLpH7.00.2牛肉膏酵母浸膏丙酮酸鈉瓊脂蒸餾水甘氨酸增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH。分裝每瓶95mL,103.43kPa高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，每95mL加入預(yù)熱至50C的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL,搖勻后制成平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在

28、冰箱貯存不得超過(guò)48h。血瓊脂培養(yǎng)基TOC o 1-5 h z成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂lOOmL脫纖維羊血（或兔血）10mL制法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50C左右無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板,置冰箱內(nèi)備用。甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g HYPERLINK l bookmark138 0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH7.4,加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa（10lb）20min滅菌備用。兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，103.43kPa（15lb）3

29、0min高壓滅菌，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm3000rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。無(wú)菌液體石蠟。操作步驟5.1增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。5.2分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在BairdParker平板，如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37C培養(yǎng)24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周?chē)腥苎?。在BairdParker平板上為圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，直徑為2mm3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐换鞚釒?，?/p>

30、其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的軟度。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌落，但無(wú)混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?，?7C培養(yǎng)24h。染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，排列成葡萄狀，無(wú)芽胞，無(wú)夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為.5um1um。甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm3mm的滅菌液體石蠟，置37C培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取1:4新鮮血漿0.5mL，放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL?；靹?，放37C恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時(shí)觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL，分別加入滅菌1:4血漿0.5mL，混勻，作為對(duì)照。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告經(jīng)增菌