電子教案與課件：《生物化學(xué)》教學(xué)PPT-2-項目二-蛋白質(zhì)化學(xué)

1、項目二 蛋白質(zhì)化學(xué)任務(wù)一 蛋白質(zhì)的分子組成一、蛋白質(zhì)的定義與生物學(xué)作用1 定義蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。2、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80。酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)含量達(dá)到50%左右，植物體內(nèi)由于糖類物質(zhì)含量高，蛋白質(zhì)含量相對含量較低，在大麥中約含10%蛋白質(zhì)。（1）蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分（2） 氧化供能可作為生物催化劑(酶)，人體有4000種

2、以上的酶都具有蛋白質(zhì)組分。是生物體的重要組成部分和生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)與核酸是細(xì)胞自我復(fù)制的的重要物質(zhì)，是制造并維護身體組織、器官的重要組分。代謝調(diào)節(jié)作用。許多激素是蛋白質(zhì)及其衍生物，如生長素、胰島素、腎上腺素、性激素等。免疫保護作用（免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞，白細(xì)胞）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲（脂肪運輸需要脂蛋白參與，運載維生素需要專門的運載蛋白完成，鐵離子需要運鐵蛋白，鐵儲存需要鐵蛋白，儲存在肝臟中）運動與支持作用，如肌肉蛋白，結(jié)締組織。參與細(xì)胞間信息傳遞，如生物膜。（3）蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能二、蛋白質(zhì)的組成1.蛋白質(zhì)的組成元素主要有C、H、O、N和 S。有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、

3、銅、鋅、錳、鈷、鉬、鈣、鎂，個別蛋白質(zhì)還含有碘 。各主要元素在蛋白質(zhì)中的含量約為C：50-55%、H：6-7%、O2：20-23%、S：0-3%。 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。 由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量（要排除非蛋白氮含量），就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 (g %)= 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100生物材料蛋白質(zhì)換算系數(shù)生物材料蛋白質(zhì)換算系數(shù)大米5.95核桃5.30小麥5.83蓖麻5.30大麥5.83芝麻籽5.30燕麥5.83葵花籽5.30玉米6.25椰子5.30花生5.46乳6.30大豆5.71蛋6.

4、25棉籽5.30肉6.25部分生物材料的蛋白質(zhì)換算系數(shù) 2.蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 根據(jù)蛋白質(zhì)的組成，可以將蛋白質(zhì)分為簡單蛋白質(zhì)與結(jié)合蛋白質(zhì)。 簡單蛋白質(zhì)完全由氨基酸組成，也稱單純蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白質(zhì)中的非蛋白部分稱為輔基。 結(jié)合蛋白質(zhì)輔基有金屬離子、磷酸基因等。有些是小分子化學(xué)物，如血紅素，黃素核苷酸等，有些則是大分子如脂類、核酸等。 結(jié)合蛋白質(zhì)種類多，但輔基少，很多蛋白質(zhì)可共用相同輔基，如肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素類蛋白質(zhì)都含有血紅素輔基，而黃素腺嘌呤二核苷酸（FDA）是許多氧化還原酶的輔基。3.蛋白質(zhì)的分子大小 分子量（MW）6000D，稱肽。已知蛋白質(zhì)分子量時，可以利氨基酸平均分子量進(jìn)行肽鏈

5、數(shù)目的估算。構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的平均分子量是138u，但并非等機率出現(xiàn)，一般分子量小的出現(xiàn)頻率更多，加權(quán)得到氨基酸的平均分子量為128，由于在聚合過程中要失去一分子水，故氨基酸殘基的分子量為110，用蛋白質(zhì)分子量除以110，就可以計算出氨基酸殘基的數(shù)目。如胰島素的分子是5734，計算可得結(jié)果為52個氨基酸殘基，實際數(shù)值為51。N 末端：多肽鏈中有游離-氨基的一端C 末端：多肽鏈中有游離-羧基的一端多肽鏈有兩端：4 蛋白質(zhì)的分類（1）根據(jù)形狀分 根據(jù)分子形狀對稱性分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。球狀蛋白，如血紅蛋白（5.5nm），球蛋白溶解性較好，能結(jié)晶，大多數(shù)蛋白屬此類。 纖維狀蛋白質(zhì)，如

6、血纖維蛋白質(zhì)，高度不對稱結(jié)構(gòu)。纖維狀蛋白質(zhì)有能溶于水，如肌球蛋白，血纖維蛋白等，大多數(shù)不溶于水，如膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲心蛋白等，在生物體內(nèi)的功能主要是起到保護作用。（2）根據(jù)分子化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)分 單純蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)根據(jù)其溶解性和輔基成分不同，可進(jìn)行進(jìn)一步的分類。單純蛋白質(zhì)的分類結(jié)合蛋白質(zhì)的分類（3）根據(jù)生物功能分類分為活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)。 活性蛋白質(zhì)是指生命過程中一切有活性的蛋白質(zhì)及其前體分子。根據(jù)其具體功能可分為酶、激素、運輸?shù)鞍?、受體蛋白、膜蛋白等。 非活性蛋白是一大類在生物體內(nèi)保護或支持作用的蛋白質(zhì)，如角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。任務(wù)二 蛋白質(zhì)的基本單位-

7、氨基酸 氨基酸是羧酸的衍生物，當(dāng)分子結(jié)構(gòu)中的-碳原子上的H原子被氨基取代后就形成氨基酸。已發(fā)現(xiàn)的氨基酸有180多種，參加蛋白質(zhì)合成的只有20種常見的氨基酸。且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外，因為甘氨酸是對稱結(jié)構(gòu)，所以沒有LD型之分）。 常見氨基酸直接由生物遺傳密碼直接編碼，而不常見氨基酸都是在已合成的肽鏈上由常見氨基酸經(jīng)專一酶催化修飾轉(zhuǎn)化而來。一、氨基酸的結(jié)構(gòu)特點與通式 20種常見氨基酸的中英文名稱和三字母簡寫見P24-25。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RC+NH3COO-H 20種氨基酸中，除脯氨酸外，結(jié)構(gòu)上的共同點是與羧酸相鄰的-碳原子上的一個H被NH2+取代。除R取代基不同外，所有

8、的-氨基酸都是相同的。除甘氨酸外，所有的氨基酸都具有旋光性，具有L-型和D-型兩種光學(xué)異構(gòu)體。蛋白質(zhì)中所有氨基酸都是L型的。二、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類1 根據(jù)R基團化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 可以分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)族三類，其中以脂肪族氨基酸最多。 脂肪族氨基酸（共15種）包括： （1）一氨基一羧基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。 （2）羥基氨基酸：絲氨酸、蘇氨酸（3）含硫氨基酸：半胱氨酸、甲硫氨酸（蛋氨基）（4）酰胺基氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺（5）一氨基二羧基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（6）二氨基一羧基氨基酸：賴氨酸、精氨酸芳香族氨基酸（共2種）：苯丙氨酸、酪氨酸雜環(huán)族氨基酸（共3種）：

9、色氨酸、組氨酸、脯氨酸 雜環(huán)化合物構(gòu)成環(huán)的原子除碳原子外，還至少含有一個雜原子。最常見的雜原子是N、S、O。可分為脂雜環(huán)、芳雜環(huán)兩大類。2. 根據(jù)R基團的酸堿性質(zhì)可以分為酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸。 酸性氨基酸（2種）：天冬氨酸和谷氨酸，側(cè)鏈含有羧基，為一氨基二羧基氨基酸。 堿性氨基酸（3種）：賴氨酸（側(cè)鏈有氨基）、精氨酸（側(cè)鏈有胍基）、組氨酸（側(cè)鏈有咪唑基），為二氨基一羧基氨基酸。中性氨基酸（15種）：其它15種氨基酸均為中性氨基酸。3. 根據(jù)R基團的帶電性質(zhì)（極性） 可以分為非極性氨基酸（疏水氨基酸）、不帶電荷的極性氨基酸和帶電荷的極性氨基酸3類，后兩者稱為親水性氨基酸。 其中，帶

10、電荷的氨基酸又可以分為帶正電荷的氨基酸和帶負(fù)電荷的氨基酸兩大類。（1）非極性氨基酸（共8種） 分別是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。它們的側(cè)鏈?zhǔn)欠菢O性基團或疏水性基團，這類氨基酸在水中的溶解度一般比親水性氨基酸要?。ǜ彼岢?Pro溶解度P28）。側(cè)鏈為脂肪烴鏈側(cè)鏈為芳環(huán)側(cè)鏈為脂肪烴側(cè)鏈為雜環(huán)（2）不帶電荷的極性氨基酸（共7種） 分別是甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。它們的側(cè)鏈R基團是不解離的極性基團或親水性基團，能與水形成氫鍵。其中甘氨酸側(cè)鏈介于極性與非極性之間，有時也歸入非極性類，由于側(cè)鏈?zhǔn)荋原子，對極性較強的-氨基和-

11、羧基影響很小，因此，將其歸入極性氨基酸比較合理。（3）帶電荷的氨基酸（共5種）帶正電荷的氨基酸（共3種）：側(cè)鏈帶有高度極性的R基團，會發(fā)生解離帶上正電荷，包括有賴氨酸、精氨酸和組氨酸，又叫堿性氨基酸。帶負(fù)電荷的氨基酸（共2種）：包括天冬氨酸和谷氨酸，又叫酸性氨基酸。3.根據(jù)營養(yǎng)價值分類 分為必需氨基酸（人體不能合成或合成量較少）和非必需氨基酸。 必需氨基酸（8種）：異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。 半必需氨基酸（2種）：組氨酸、精氨酸。如組氨酸是嬰幼兒必需氨基酸，會缺乏時會患濕疹。 人體必需氨基酸有8種，分別為亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇

12、氨酸、色氨酸和纈氨酸。記憶口決：假設(shè)借來一二本書：甲硫氨酸、色氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸。4、組成蛋白質(zhì)的不常見氨基酸 如 -丙氨酸是構(gòu)成維生素泛酸的主要成分。D-苯丙氨酸參與組成抗生素短桿菌肽S。同型半胱氨酸是甲硫氨酸代謝產(chǎn)物。瓜氨酸和鳥氨酸是尿素合成中間產(chǎn)物。-氨基丁酸（-GABA）是谷氨酸脫羧產(chǎn)物，是抑制神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦中含量較高。一些非蛋白質(zhì)氨基酸已被開發(fā)并作為藥物應(yīng)用于臨床的疾病治療。 這些氨基酸不是在蛋白質(zhì)合成過程中加入的，而是在蛋白質(zhì)合成后由酶催化由常見氨基酸轉(zhuǎn)化的。如動物結(jié)締組織中的膠原蛋白含有4-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸，肌肉中的肌球蛋白含有N-甲

13、基賴氨酸，凝血酶中含有-羧基谷氨基。 5、非蛋白氨基酸 在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的氨基酸中，除20種常見氨基酸和少數(shù)不常見氨基酸之外，絕大多數(shù)種類氨基酸不參與蛋白質(zhì)構(gòu)成，稱非蛋白質(zhì)氨基酸，這些氨基酸通常是常見氨基酸的衍生物，也有一些是-氨基酸、-氨基酸、-氨基酸，甚至是D-氨基酸。如在維生素B3中含有-丙氨酸，在尿素循環(huán)途徑中有L-瓜氨酸和L-鳥氨酸， -氨基丁酸是一種重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)，細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖中含有D-丙氨酸和D-谷氨酸。 作業(yè)1. 請寫出常見20種氨基酸的中文名稱及對應(yīng)的三字母縮寫。2.請根據(jù)氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)不同，將氨基酸進(jìn)行分類，并標(biāo)示其極性和帶電特性？作業(yè)收齊后交制藥樓223三、氨基酸

14、理化性質(zhì) （一）氨基酸的物理性質(zhì)1.晶體形狀 各種氨基酸均為無色結(jié)晶，晶形有差異，可作為氨基酸鑒定的依據(jù)。而且氨基酸構(gòu)形不同，晶形也不同。如L-谷氨酸是四角柱形，而D型則是菱片狀結(jié)晶。 除半胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水，均能溶于稀酸、稀堿溶液，除脯氨酸和羥脯氨酸能溶于乙醇或乙醚外，其它均不能溶于有機溶劑。 2 熔點 由于氨基酸以兼性離子形式存在， 因此，其熔點比相應(yīng)的羧酸或 胺類要高些，一般在200-300之間；不同氨基酸差別較大，較低的如半胱氨酸為178 ，較高的如酪氨酸為342-344，有些氨基酸還未達(dá)到熔點溫度就開始分解了（如谷氨酸鈉受熱分解）。常見氨基酸的熔點P273 氨基酸的味感 各

15、種氨基酸都有一定的味感，味感與氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型有關(guān)。一般D-型氨基酸多數(shù)有甜味，而L-型氨基酸有甜、苦、鮮、酸等4種味感。其中疏水性氨基酸多具有苦味，而親水性氨基酸多具有甜味，兩種氨基酸的鈉鹽具有顯著的鮮味。常見氨基酸的味感見P275. 溶解度 各種氨基酸分子中均有-氨基和-羧基等極性基團，因此都能溶于水，但不同氨基酸在水中溶解性有巨大差異。如酪氨酸在水中溶解度每100mL僅溶解0.04g，而脯氨酸在水中溶解度則很大，每100mL可溶解162g。 所有氨基酸都易溶于稀酸和稀堿溶液中，不溶于乙醚、氯仿等非極性溶劑。常見L-氨基酸在不同溫度條件下在水中的溶解度見P286.旋光性 常見氨基酸除甘氨

16、酸沒有不對稱碳原子外，其余均有不對稱碳原子，因此，均有旋光性。 氨基酸的旋光度除與側(cè)鏈R基性質(zhì)有關(guān)外，還與測定時的pH有關(guān)，這是因為氨基酸為兩性電解質(zhì)，在不同pH條件下氨基和羧基的解離狀態(tài)不同。比旋光度是一個可以進(jìn)行氨基酸鑒別和純度測定的物理常數(shù)。常見氨基酸的比旋光度見P296.紫外吸收性質(zhì) 標(biāo)準(zhǔn)20種氨基酸在可見光區(qū)域均沒有吸收，均為無色晶體，在遠(yuǎn)紫外區(qū)（pI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子 陽離子陰離子 氨基酸的等電點可以利用pK值計算得到，對于側(cè)鏈不解離的中性氨基酸： 而對于側(cè)鏈R基團含有可解離的酸性氨基酸和堿性氨基酸，由于這些氨基酸含有三個可解離基團，其完全質(zhì)子化可以看成是一

17、個三元酸，存在3步解離，具有4種不同的離子形式。在進(jìn)行等電點計算時，要先寫出解離方程式，從中找出兼性離子形式，等電點pI應(yīng)為兼性離子形式兩側(cè)的兩個pK值的一半。對于酸性離子 ， ，如天冬氨酸，pI=(2.09+3.86)/2=2.98 對于堿性離子， ，如賴氨酸，pI=(8.95+10.53)/2=9.74在pI點，氨基酸所帶凈電荷為零；當(dāng)pHpI時，氨基酸酸性解離大于堿性解離，而帶上負(fù)電荷。 在電場環(huán)境下，帶正電荷的氨基酸向負(fù)極移動，而帶負(fù)電荷的氨基酸向正極移動，兼性離子則在電場中不移動，這就是電泳法分離氨基酸的基本原理。 如要分離丙氨酸（pI=6.02），賴氨酸（pI=9.74）和谷氨酸（

18、pI=3.22）可在pH=6.02的緩沖條件下進(jìn)行電泳，此時，賴氨酸（pHpI）帶負(fù)電荷，將向正極移動，而丙氨酸，則不移動，從而得以分離。8 疏水性 氨基酸的疏水性（hydrophobicity）為1mol氨基酸從水溶液轉(zhuǎn)移至乙醇溶液時所產(chǎn)生的自由能變化。 不考慮活度系數(shù)變化前提下，Go=-RTln(S乙醇/S水)，其中S乙醇和S水分別為氨基酸在乙醇和水中的溶解度，單位為mol/L。 氨基酸結(jié)構(gòu)可分為甘氨酸基和側(cè)鏈，假定甘氨酸側(cè)鏈（R=H）的Go為0，則Go=Go（甘氨酸）+Go（側(cè)鏈），所以，氨基酸側(cè)鏈殘基的疏水性Go（側(cè)鏈）=Go-Go（甘氨酸）。氨基酸側(cè)鏈殘基的疏水性常用Tanford法

19、測定。常見氨基酸側(cè)鏈的疏水性見P30。（二）氨基酸的一般化學(xué)性質(zhì)1. -氨基參與的反應(yīng) （1）與亞硝酸反應(yīng) 氨基酸的游離-氨基可與亞硝酸反應(yīng)，生成-羥基酸和氮氣。 生成氮氣分子一半的氮來自于氨基酸，另一半來自亞硝酸，該反應(yīng)是范式（Van Slyke）定氮法的理論基礎(chǔ)。 脯氨酸為亞氨基酸，沒有游離-氨基，因而不能發(fā)生此反應(yīng)。賴氨酸除了-氨基外，還有-氨基也能發(fā)生亞硝酸反應(yīng)生成氮氣，但反應(yīng)速率較慢，控制反應(yīng)時間在3-4min， -氨基可作用完全。（2）?；蜔N基化反應(yīng) 氨基酸與?；噭┗驘N基化試劑反應(yīng)， -氨基上的氫原子被?；驘N基取代，生成相應(yīng)的產(chǎn)物。其反應(yīng)通式為： 生成的取代產(chǎn)物對氨基酸的

20、氨基具有保護作用，常用于多肽及蛋白質(zhì)人工合成時保護氨基以及蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定時進(jìn)行N-末端氨基酸分析與測定。 常用的?；噭┯衅S氧甲酰氯、叔丁氧甲酰氯、對-甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酸酐、丹磺酰氯，等等。常用的烴基化試劑有2,4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB，也稱Sanger試劑）和苯異硫氰酸酯（PITC）。 2,4-二硝基氟苯，也稱Sanger試劑，在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。常用來鑒定蛋白質(zhì)和多肽的N-末端氨基酸殘基。 苯異硫氰酸酯（PITC）和氨基酸反應(yīng)比較特殊，PITC在弱堿性條件下先和氨基酸反應(yīng)生成烴基化產(chǎn)物苯氨基硫甲酰氨基酸（P

21、ITC-AA），此化合物在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-AA）。此反應(yīng)在多肽和蛋白質(zhì)氨基酸序列分析中具有特殊重要作用。（3）形成希夫堿（Schiffs base） 氨基酸-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿，稱為希夫堿。 賴氨酸側(cè)鏈的-氨基也可以發(fā)生該反應(yīng)。希夫堿是某些酶促反應(yīng)，如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物。（4）脫氨基反應(yīng)氨基酸在氧化劑或氨基酸氧化酶的作用下發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)生成相應(yīng)的-酮酸。 此反應(yīng)是生物體氨基酸分解代謝的第一步。氨基酸只有脫氨基后才能在體內(nèi)進(jìn)行代謝。2. -羧酸參加的反應(yīng)（1）成鹽和成酯反應(yīng) 氨基酸與堿作用即生成鹽，如氨基酸鈉鹽。氨基酸的重金屬鹽不溶于水

22、。氨基酸的羧基與醇反應(yīng)可以得到相應(yīng)的酯。如在干燥HCl氣體條件下，氨基酸與無水甲醇或乙醇就得到相應(yīng)的甲酯或乙酯。當(dāng)氨基酸在成鹽、成酯后，羧基的化學(xué)性質(zhì)被保護，而氨基的化學(xué)性質(zhì)得到加強，容易與?；?、烴基等發(fā)生反應(yīng)。 也有一個例外：氨基酸與對硝基苯酚生成相應(yīng)的對硝基苯酯后，羧基的反應(yīng)活性反而增強了，易發(fā)生酰化反應(yīng)，這種酯稱為活化酯。 氨基酸的成鹽、成酯反應(yīng)在多肽與蛋白質(zhì)合成中經(jīng)常被用到。 （2）成酰氯反應(yīng) 氨基酸的氨基經(jīng)保護后，其羧基可以和五氯化磷或二氯亞砜等作用生成相應(yīng)的酰氯。 氨基酸生成相應(yīng)的酰氯后羧基被活化，容易與另一個氨基酸的氨基之間形成肽鍵，因而，此反應(yīng)在多肽人工合成中經(jīng)常使用。（3）疊

23、氮反應(yīng) 氨基酸的氨基用適當(dāng)基團保護后，羧基經(jīng)酯化后生成相應(yīng)的酯，然后再與肼和亞硝酸反應(yīng)，生成疊氮化合物。生成的疊氮化合物同樣使羧基被活化，此反應(yīng)也應(yīng)用于多肽人工合成中。（4）脫羧基反應(yīng) 生物體內(nèi)，氨基酸在氨基酸脫羧酶的催化下脫去羧酸生成相應(yīng)的伯胺并放出二氧化碳。脫羧酶專一性很強，一種氨基酸脫羧酶只能催化一種特定的氨基酸脫羧，而不能催化其它的氨基酸脫羧。 在發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的過程中，可以利用該反應(yīng)進(jìn)行氨基酸的產(chǎn)量。加入特定的氨基酸脫羧酶后，利用瓦勃呼吸計可以定量測定CO2量，從而計算出氨基酸的量。3. -氨基和-羧基共同參加的反應(yīng) （1）茚三酮反應(yīng) 在弱酸性溶液中，將-氨基酸和茚三酮共熱發(fā)生氧化

24、還原反應(yīng)，氨基酸氧化脫氨、脫羧，生成相應(yīng)的醛、氨和CO2，茚三酮被還原成還原茚三酮。而還原茚三酮、氨和水合茚三酮共同作用生成一種藍(lán)紫色的物質(zhì)。氨基酸和茚三酮反應(yīng)的顏色與條件_陳忠云：/view/6f69d368783e0912a2162a49.html 茚三酮反應(yīng)非常靈敏，廣泛用于氨基酸的定性和定量分析，該藍(lán)色物質(zhì)在570nm有最大吸收，在0.5-50g/mL范圍內(nèi)，氨基酸含量與吸光值成正比。 脯氨酸是亞氨基酸，與茚三酮反應(yīng)并不釋放氨氣，也不會生成藍(lán)色物質(zhì)，而是直接生成一種黃色物質(zhì)，此化合物的最大吸收波長在440nm。（2）合成肽反應(yīng) 一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間脫水縮合生成酰胺化

25、合物為肽，形成酰胺鍵為肽鍵。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽。如甘氨酸和丙氨酸反應(yīng)如下： 這兩種肽是完全不同的兩類化合物，因此，兩種不同的氨基酸可以形成兩種二肽，三種不同的氨基酸可以形成6種三肽，而n種不同的氨基酸可以形成n!種不同的多肽。 許多氨基酸的側(cè)鏈R基代有可發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的官能團， 包括Ser、Thr的羥基，Tyr的酚羥基，Cys的巰基，Trp的吲哚基，His的咪唑基，Arg的胍基，Met的甲硫基，Lys的氨基，Asp、Glu的側(cè)鏈羧基等等。這些側(cè)鏈可以發(fā)生很多化學(xué)反應(yīng)，可用于氨基酸的定性定量分析和蛋白質(zhì)化學(xué)修飾。（1）Cys巰基參加的反應(yīng) 半胱氨酸的巰基（-SH）是一個化學(xué)性質(zhì)很活潑的反

26、應(yīng)基團，可發(fā)生很多反應(yīng)。巰基很容易被氧化，氧化方式常見有2種。在較弱的氧化劑作用下，兩個Cys巰基之間發(fā)生氧化，形成二硫鍵，產(chǎn)物是胱氨酸。4. 由側(cè)鏈R基參與的反應(yīng) 此反應(yīng)可逆，在還原劑如巰基乙醇（ -巰基乙醇）、二硫蘇糖醇等作用下，胱氨酸的二硫鍵打開，重新形成兩個半胱氨酸。 -S-S-/-SH自成一個氧化還原體系，在機體氧化還原作用中起一定的作用。二硫鍵廣泛存在于蛋白質(zhì)分子中，它們將不同的多肽肽或一和條多肽鏈的不同部位連接到一起，對于穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用。 在較強的氧化劑如過甲酸的作用下，巰基或二硫鍵被氧化成磺酸基。此反應(yīng)不可逆，常在測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)時用來打開二硫鍵。 巰基

27、易與烷化劑，如碘乙酸、對氯汞苯甲酸等作用生成相應(yīng)穩(wěn)定的烷基化衍生物。有許多蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性與Cys的巰基直接有關(guān)，當(dāng)烷化劑與巰基作用后可使這些蛋白質(zhì)失去活性。（2）Tyr的酚基參加的反應(yīng) Tyr（酪氨酸）的酚羥基在堿性條件下具有還原性，可以使Folin-酚試劑（含磷鉬酸和磷鎢酸）還原生成藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，在680nm下有最大吸光。利用Folin試劑可以對酪氨酸進(jìn)行定量測定。 蛋白質(zhì)分子由于含有酪氨酸（色氨酸也有此反應(yīng)），可以常用此法進(jìn)行定量測定，此外，還可以用此法進(jìn)行蛋白酶活力測定。 Tyr的酚基在羥基兩側(cè)的3位和5位容易發(fā)生親電取代反應(yīng)，如發(fā)生碘化和硝化，此外，還可以和重氮化合物結(jié)合生成橘

28、黃色的化合物，此反應(yīng)稱為Pauly反應(yīng)，也被用于檢測酪氨酸。氨基酸側(cè)鏈基團的部分化學(xué)反應(yīng)5.氨基酸的甲醛滴定 氨基酸在水溶液中主要以兩性離子存在，但由于氨基酸在水溶液中酸度很低，無法直接用堿進(jìn)行滴定。要使反應(yīng)進(jìn)行到底，必需要使反應(yīng)終點pH在12-13范圍內(nèi)，這么高的pH條件下沒有合適的指示劑指示反應(yīng)終點，所以不能直接滴定。 加入甲醛反應(yīng)促使氨基酸電離產(chǎn)生H+，使其pH下降，就可以用酚酞作指示劑，用NaOH直接滴定，根據(jù)消耗的NaOH量就可以計算出氨基酸中氨基的量，即氨基酸的含量。此法可用于游離氨基酸的測定，大體判斷蛋白質(zhì)水解或合成程度。 在中性條件下，若在氨基酸溶液中加入過量的甲醛，能與-NH

29、2很快反應(yīng)生成羥甲基衍生物和二羥甲基衍生物。 由于甲醛的存在，使解離后的氨基酸（A-）不斷被反應(yīng)掉，大大促進(jìn)了氨基酸-NH3+的解離，使該反應(yīng)的終點由pH12-13降到9附近，落入酚酞的指示范圍，因此，可以利用NaOH滴定來指示終點。 甲醛滴定法是一種常用的氨基酸測定方法，測得結(jié)果常用氮含量來表示氨基酸含量，稱為甲醛氮。甲醛滴定法測定氨基酸：/view/66002cc84028915f804dc240.html?from=search （三）肽和肽鍵 （一）肽鍵 是一個氨基酸的-羧基和另一個氨基酸的-氨基縮合脫去1分子水形成的酰胺鍵。（二）肽 肽是氨基酸的線性聚合物。每條肽鏈有自由氨基的一端稱

30、為氨基末端或N端，有自由羧基的一端稱為羧基末端或C端。由于氨基酸之間通過脫水縮合形成酰胺鍵，氨基酸結(jié)構(gòu)不完整，常稱氨基酸殘基。任務(wù)三 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括: 高級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure)一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primary structure） 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)又稱為共價結(jié)構(gòu)，是指肽鍵中的氨基酸殘基排列順序。 一級結(jié)構(gòu)研究不僅包括肽鏈中氨基酸順序，還包括肽鍵數(shù)目，末端氨基酸殘基種類，鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵位置等

31、。一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。牛胰島素一級結(jié)構(gòu) 肽的化學(xué)名稱是根據(jù)氨基酸的順序由N-末端開始向C-末端閱讀，稱為某氨酰某氨酰某氨基酸，C末端的氨基酸讀作某氨基酸。 如下面由5個氨基酸組成的5肽讀為丙氨酰谷氨酰亮氨酰纈氨酰組氨酸，簡寫為Ala-Glu-Leu-Val-His。 Mw6000稱為蛋白質(zhì)。 多肽鏈存在順式和反式兩種構(gòu)型。正常情況下，由于順式結(jié)構(gòu)使-碳原子的R基團相互靠近而產(chǎn)生空間位阻，因此，多肽鏈都是反式構(gòu)型。 一個特例是含有Pro的肽鍵可以是順式，也可以是反式存在。 氨基酸的序列決定了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。一級結(jié)構(gòu)中的某些位點的氨基酸殘基可以被其它氨基酸殘基取代

32、，甚至成片缺失，并不影響或很少影響蛋白質(zhì)的生物功能，這些位點的氨基酸稱為可變氨基酸。而一級結(jié)構(gòu)中的另一些位點的氨基酸的保守性很強，一旦被取代或缺失，則導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)功能嚴(yán)重降低甚至喪失，這些氨基酸稱為保守氨基酸。一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能胰島素氨基酸殘基序號A5A6A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla馬ThrSerIleAla（1）一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系 蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象即空間結(jié)構(gòu)由其氨基酸序列決定，直接證據(jù)來源于20世紀(jì)60年代White和

33、Anfinsen所做的牛胰核糖核酸酶復(fù)性實驗。 牛胰核糖核酸酶由124個氨基酸組成，有4對二硫鍵。牛胰核糖核酸酶通過4個二硫鏈及次級鍵，肽鏈盤曲折疊成三級結(jié)構(gòu)，具有活性。（2）同源蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)是指在不同生物體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)，如血紅蛋白。同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)有許多相似之處，常具有相同或相近肽鏈長度，并且在很多位點上的氨基酸是相同的，被稱為不變氨基酸，其它位點上的氨基酸殘基對于不同來源的蛋白質(zhì)可能會有所變化，稱為可變殘基。同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序上存在的這種相似性稱為順序同源現(xiàn)象，對該現(xiàn)象的研究有助于對生物進(jìn)化中的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，繪制出進(jìn)化樹。細(xì)胞色素c（Cyt

34、C）目前順序同源現(xiàn)象研究最多的蛋白質(zhì)。不同生物Cyt C與人Cyt C氨基酸殘基的差異數(shù)生物類型氨基酸差異數(shù)生物類型氨基酸差異數(shù)黑猩猩0響尾蛇14猴子1海龜15兔1金槍魚21豬、牛、羊10小蠅25狗11蛾31驢11小麥35馬12粗糙鏈孢霉43雞13酵母44黑猩猩與人的基因組相似度高，常用于藥物的動物試驗，如HIV病毒試驗細(xì)胞色素C構(gòu)建的物種進(jìn)化樹（3）一級結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)（酶原）激活 生物體內(nèi)有些蛋白質(zhì)是以沒有活性的前體形式合成的，稱蛋白質(zhì)原。蛋白質(zhì)原的部分肽鏈需按照特定方式斷裂才能具有活性，這一過程稱蛋白質(zhì)激活。如胰島素以前胰島素原形式合成，其N端有一段信號肽，是分泌蛋白質(zhì)的標(biāo)志，進(jìn)入

35、到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，在信號肽酶的作用下，信號肽被切除，生成胰島素原。胰島素原含有一段連接肽，在連接肽切除后，才能形成活性的胰島素分子。胰島素在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程 許多酶類，如蛋白水解酶也都是以無活性的酶原形式合成，只有被分泌到特定部位后，在專門的激活劑的幫助下，一級結(jié)構(gòu)發(fā)生局部斷裂，才有催化活性。（4）一級結(jié)構(gòu)與分子病每一種蛋白質(zhì)都有其特定的生物學(xué)功能，因蛋白質(zhì)生物大分子組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致的疾病稱為分子病。鐮刀狀貧血病是最早被認(rèn)識的一種分子病，流行于非洲一些地區(qū)?；颊哐杭t細(xì)胞形態(tài)異常，有很多呈新月狀或鐮刀狀，在紅細(xì)胞脫氧時鐮刀狀細(xì)胞數(shù)量增加，嚴(yán)重時導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂、溶血而致命。致病原因是患者的血紅蛋

36、白異常。A.正常的血細(xì)胞，血紅蛋白肽鏈中的第六個氨基酸是谷氨酸；B.鐮形細(xì)胞，其血紅蛋白的第六個氨基酸是纈氨酸 血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)攜氧的重要功能蛋白質(zhì)，為四聚體蛋白質(zhì)，由兩個亞基和兩個亞基組成（ 22 ），其中亞基包含141個氨基酸， 亞基包含146個氨基酸?；颊哐t蛋白（HbS）的亞基的N-末端的第6位的氨基由原來正常血紅蛋白（HbA）的高度極性的Glu變與非極性的Val。這種改變導(dǎo)致血紅蛋白表面電荷減少，在脫氧狀態(tài)下溶解度下降，發(fā)生不正常聚集，形成鐮刀狀紅細(xì)胞，嚴(yán)重時甚至出現(xiàn)紅細(xì)胞破裂溶血。血紅蛋白共有574個氨基酸殘基組成，僅在兩個亞基上各改變一個氨基酸殘基，生理功能卻發(fā)生了極在變化，可

37、見，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)對于功能具有重要的決定性作用。二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，也稱空間結(jié)構(gòu)。只有特定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才能表現(xiàn)出生物功能。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是依靠肽鍵（共價鍵）維持的，而高級結(jié)構(gòu)維持則通過眾多化學(xué)鍵來維持。（一）維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性主要靠大量弱的相互作用即非共價鍵或次級鍵來維系，其中包括氫鍵、范德華力、疏水作用、鹽鍵。這些次級鍵的鍵能往往比共價鍵低很多，但卻是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)維持的重要和主要力量。 此外，還有兩種共價鍵-二硫鍵和配位鍵（常與金屬共價配位螯合）在維持某些蛋白質(zhì)的構(gòu)象中也起著重要作用。（1）氫鍵 在多

38、肽主鏈上，存在大量的羰基和亞氨基（每個氨基酸殘基都含有一個羰基和一個亞氨基），亞氨基是理想的供氫體，而羰基的氧原子是理想的受氫體，它們之間形成氫鍵。 多肽主鏈的羰基和亞氨基之間形成的氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的最主要的作用力。部分氨基酸側(cè)鏈也帶有形成氫鍵的基團，如Ser、Thr的羥基，Tyr的酚羥基，Cys的巰基，Asp、Glu的側(cè)鏈羧基等。 側(cè)鏈之間以及側(cè)鏈與主鏈之間形成的氫鍵也是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要力量。（2）疏水作用 也稱疏水鍵，是指非極性基團為了避開極性環(huán)境而聚集到一起的作用力。 20種常見的氨基酸中有8種屬于疏水性氨基酸，即Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Pro，大

39、多分布在球狀蛋白質(zhì)的內(nèi)部。 疏水氨基酸側(cè)鏈之間形成的疏水作用對于維系蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)具有特別重要的作用。（3）范德華力 范德華力實質(zhì)上也是靜電力，主要表現(xiàn)為極性基團永久偶極之間的靜電相互作用（定向效應(yīng)）、極性基團永久偶極與非極性基團誘導(dǎo)偶極之間的靜電相互作用（誘導(dǎo)效應(yīng)）、非極性基團的瞬時之間的靜電相互作用（分散效應(yīng)）。 范德華力雖然很弱，但存在范圍廣泛，數(shù)量巨大，可存在于極性基團之間，也可存在于極性與非極性基團之間，或存在于非極性基團之間。范德華力成為維持蛋白質(zhì)三級和四級結(jié)構(gòu)不可忽視的作用力。 （4） 鹽鍵 也稱為離子鍵，是由正負(fù)離子之間的靜電所形成的化學(xué)鍵。在生理pH條件下，酸性氨基酸側(cè)

40、鏈帶負(fù)電荷，而堿性氨基酸側(cè)鏈帶正電荷。多數(shù)情況下，這些氨基酸分布于球狀蛋白質(zhì)的表面，與水及溶液中的離子發(fā)生相互作用，但有時，少數(shù)相反電荷的側(cè)鏈也出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部形成鹽鍵。鹽鍵的強弱受環(huán)境pH、溶劑種類、鹽濃度等影響較大。（6）二硫鍵 二硫鍵形成于兩個Cys-SH之間，屬共價鍵?？蓪⒉煌嚯逆溁蛲粭l多肽鏈不同部位相連接。因為只有當(dāng)肽鏈形成特定的空間結(jié)構(gòu)后，才能形成正確的二硫鍵配對，所以二硫鍵并不指導(dǎo)肽鏈的折疊，但對其空間構(gòu)象起著穩(wěn)定作用。 二硫鍵數(shù)目越多，蛋白質(zhì)抗外界因素的作用力就越強，因此，在生物體內(nèi)一些起著保護作用的蛋白質(zhì)往往含有很多的二硫鍵。 此外，還有一些二硫鍵是蛋白質(zhì)行使生物功

41、能所必需的。2. 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondary structure） 是指肽鏈中的主鏈借助氫鍵（肽鍵中的酰胺氮和羰基氧之間形成氫鍵），有規(guī)則的卷曲折疊成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，主要研究內(nèi)容是肽鏈的共價主鏈，而不涉及側(cè)鏈R基團的空間排布，是蛋白質(zhì)的構(gòu)象單元?；径壗Y(jié)構(gòu)有：-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等。CD可用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定。（1）-螺旋 是蛋白質(zhì)分子中最常見且最穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象，它是多肽主鏈環(huán)繞一個中心軸有規(guī)律的盤旋前進(jìn)形成的螺旋型構(gòu)象。由于該螺旋最初被發(fā)現(xiàn)于-角蛋白中，故稱為-螺旋，分為左手螺旋和右手螺旋兩種，天然蛋白質(zhì)中存在的主要是右手螺旋，只在嗜熱菌蛋白

42、酶中發(fā)現(xiàn)一圈左手螺旋。-螺旋結(jié)構(gòu)特點P35。（2）-折疊 又稱-結(jié)構(gòu)、-構(gòu)象， - 片層，是蛋白質(zhì)分子中又一種常見的二級結(jié)構(gòu)，該構(gòu)象是一種較伸展的構(gòu)象，由兩條或兩條上的肽段充分伸展并側(cè)向聚集，按肽鏈長軸方向平行排列在一起，相鄰肽鏈的羰基和亞氨基之間（肽鏈間形成氫鍵）形成有規(guī)則的氫鍵的一種折疊片層結(jié)構(gòu)。如蠶絲絲心蛋白幾乎全部由堆積的反平行-折疊結(jié)構(gòu)組成。球狀蛋白質(zhì)中也廣泛存在這種結(jié)構(gòu)，如溶菌酶、核糖核酸酶、木瓜蛋白酶等球狀蛋白質(zhì)中都含有-折疊結(jié)構(gòu)。NH，來自亞氨基O，來自COOH-折疊結(jié)構(gòu)的特點：（1）主鏈走向呈折疊狀，相鄰肽平面依次折疊成鋸齒狀，側(cè)鏈交錯伸向鋸齒樣結(jié)構(gòu)左下方。（2）兩條以上肽鏈

43、（或同一條多肽鏈的不同部分）平行排列，相鄰肽鏈之間靠肽鍵的羰基氧（CO）和亞基氫（N-H）形成氫鍵相連，氫鍵方向與肽鏈長軸垂直。（3）有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)。肽鏈N端在同側(cè)為順式，不同側(cè)為反式。反式結(jié)構(gòu)比順式結(jié)構(gòu)要穩(wěn)定。鏈間有氫鍵相連。氫鍵也是維持-折疊結(jié)構(gòu)的主要作用力。形成折疊的氨基酸殘基較小且不帶同種電荷。甘氨酸和丙氨酸在-折疊中出現(xiàn)頻率較高。蠶絲蛋白幾乎都是-折疊結(jié)構(gòu)。（3）-轉(zhuǎn)角 又稱-彎曲或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，是球狀蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的第三種二級結(jié)構(gòu)，可占 到球狀蛋白質(zhì)全部氨基酸殘基的1/4。 球狀蛋白質(zhì)分子肽鏈在盤旋過程中往往發(fā)生1800的急轉(zhuǎn)彎，這種回折部位的構(gòu)象即為-轉(zhuǎn)角。常發(fā)現(xiàn)pro的存在。轉(zhuǎn)

44、角的第二個氨基酸殘基常為脯氨酸，其他殘基有Gly、Asn、Asp和Trp等。常見轉(zhuǎn)角含有4個氨基酸殘基，有兩種類型：轉(zhuǎn)角I特點：第一個氨基酸殘基羰基氧與第四個殘基的酰氨氮之間形成氫鍵；轉(zhuǎn)角第三個殘基往往是Gly.這兩種轉(zhuǎn)角中的第二個氨基酸殘基大都是脯氨酸。（4）無規(guī)則卷曲 也稱自由回轉(zhuǎn)，是指沒有一定規(guī)律的松散結(jié)構(gòu)，這是一種不規(guī)則的構(gòu)象，是多肽主鏈多向性隨機盤旋所形成的構(gòu)象，常見于球狀蛋白質(zhì)分子中，使蛋白質(zhì)肽鏈整體形成球狀構(gòu)象。 無規(guī)則卷曲不是任意形成，在同一種蛋白分子的相應(yīng)部位，無規(guī)則卷曲的具體位點和結(jié)構(gòu)是完全一樣的，由一級結(jié)構(gòu)決定的。因此，從某種意義上來說，無規(guī)則卷曲是有規(guī)律可循的，是一種穩(wěn)

45、定的構(gòu)象。 酶的功能部位常處于這種構(gòu)象區(qū)域，使酶的活性中心具有柔性。（5）超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域（自學(xué)）超二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中由若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元（-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角等）組合在一起，彼此相互靠近，形成在空間上能辨認(rèn)的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合體。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次上，超二級結(jié)構(gòu)高于二級結(jié)構(gòu)，低于結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)。超二級結(jié)構(gòu)最基本組合形式有3種，即-螺旋聚集體（）， -折疊聚集體（）和-螺旋與-折疊的聚集體（）。在多數(shù)情況下，形成超二級結(jié)構(gòu)時，二級結(jié)構(gòu)之間的接觸面是由非極性氨基酸殘基以疏水鍵發(fā)生相互連接，穩(wěn)定超二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，而極性氨基酸殘基大多位于超二級結(jié)構(gòu)表面。較大蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)往往

46、由幾個相對獨立的三維實體構(gòu)成，這些三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是在三級結(jié)構(gòu)與超二級結(jié)構(gòu)之間的一個組織層次。一條長的多肽鏈可先折疊成幾個相對獨立的結(jié)構(gòu)域，然后再締合成三級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域常有相對獨立的生理功能，如一些要分泌到細(xì)胞外的蛋白，其信號肽就構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)域，此外，還有些殘基修飾有關(guān)的結(jié)構(gòu)域、與酶原激活有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。3. 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 球狀蛋白質(zhì)在一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行三維多向性盤旋形成近似球狀的構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)討論的是共價主鏈的構(gòu)象，而三級結(jié)構(gòu)則涉及主鏈和側(cè)鏈所有的原子和原子團的空間排布關(guān)系，但不討論亞基間和分子間的排布。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是由一級結(jié)構(gòu)決定的，其

47、中二級結(jié)構(gòu)決定于氨基酸的短程順序，三級結(jié)構(gòu)氨基酸的長程順序。 二硫鍵是維持三級結(jié)構(gòu)唯一的共價鍵。維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用鍵4. 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 由多條肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子中，每一條肽鏈都獨立形成三級結(jié)構(gòu)，這樣的三級結(jié)構(gòu)單位再相互締合，則形成了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，即蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，這樣的蛋白質(zhì)被稱為寡聚蛋白，寡聚蛋白分子中的每個結(jié)構(gòu)單位稱為一個亞基或亞單位（subunit）。 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指寡聚蛋白分子中亞基與亞基在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式，亞基的數(shù)目和種類也是四級結(jié)構(gòu)的研究內(nèi)容，但不涉及亞基本身的構(gòu)象（是三級結(jié)構(gòu)研究內(nèi)容）。血紅蛋白（HB）四級結(jié)構(gòu)（multiple subuni

48、t）肌紅蛋白 (Mb) 三級結(jié)構(gòu)(mono-subunit) 5. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能 （1）單亞基蛋白質(zhì)（肌紅蛋白、胰島素） 肌紅蛋白是哺乳動物肌肉中儲氧的蛋白質(zhì)，由一條多肽鏈和一個血紅素輔基構(gòu)成，屬結(jié)合蛋白質(zhì)。相對分子質(zhì)量為16 700，由153個氨基酸殘基組成，主鏈中約有75%氨基酸以-螺旋結(jié)構(gòu)存在，螺旋分為8段，分別以A、B、C、D、E、F、G、H編號，肌紅蛋白分子內(nèi)還含有非螺旋區(qū)，由-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。分子內(nèi)部只有一個能容納4個水分子的空間。平面形的血紅素處于分子表面的一個洞穴內(nèi)。血紅素也稱鐵卟啉，由原卟啉IX和一個Fe2+組成，卟啉中心的Fe2+有六個配位鍵，四個分別與卟啉環(huán)中的

49、4個N原子結(jié)合， 另外兩個配位鍵垂直于環(huán)平面，其中一個與肽鏈93位His殘基（F8）中咪唑基的N原子結(jié)合，另一個處于開放狀態(tài)，用來與O2可逆結(jié)合。Fe2+在水環(huán)境中很容易被氧化成Fe3+而失去與氧結(jié)合的能力，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象為血紅素提供了一個疏水環(huán)境，避免Fe2+發(fā)生氧化，保證了血紅素的氧合能力。 肌紅蛋白 (Mb) myoglobin153 AA1 HemeAH八段-螺旋無-S-S-鍵功能：儲存O2 胰島素分子由A、B兩條多肽鏈組成，通過二硫鍵形成整體，三級結(jié)構(gòu)是其最高層次的結(jié)構(gòu)。胰島素是一種激素，經(jīng)血液循環(huán)到靶細(xì)胞表面時，與細(xì)胞膜上的受體發(fā)生專一性結(jié)合，這種結(jié)合的結(jié)合部位就是胰島素的活性中

50、心。該活性中心位于分子表面，由兩部分組成，一部分具有相當(dāng)面積的疏水區(qū)，它是活性中心的主體，由幾個芳香族氨基酸殘基組成，它們對于胰島素的 生物活性至關(guān)重要。另一部分分散在疏水區(qū)周圍的一些帶電荷或極性基團，活性中心，特別是疏水區(qū)的氨基酸殘基一旦發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，將直接導(dǎo)致胰島素活性的下降或喪失。（2）多亞基蛋白質(zhì)-血紅蛋白 血紅蛋白是血液紅細(xì)胞的主要成分，起著輸送氧氣和二氧化碳的作用。成人紅細(xì)胞中有兩種血紅蛋白，分別稱為HbA和HbA2，其中HbA占總量的96%以上，是主要的血紅蛋白。相對分子質(zhì)量約64 000，亞基組成為22。由兩個亞基和兩個亞基組成的四聚體蛋白質(zhì)，其中亞基由141個氨基酸組成， 亞

51、基由146個氨基酸組成，四個亞基各結(jié)合有一個血紅素輔基，因此，血紅蛋白分子有4個O2結(jié)合位點。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)血紅蛋白的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：相鄰AA間的共價結(jié)合二級結(jié)構(gòu)：短距離AA之間的非共價連接三級結(jié)構(gòu)：遠(yuǎn)距離AA之間的非共價連接四級結(jié)構(gòu)：多肽鏈之間的非共價連接（3）變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)一些效應(yīng)劑可與某些蛋白質(zhì)分子特定部位可逆地結(jié)合，而使其構(gòu)象改變，從而改變生物活性，稱變構(gòu)效應(yīng)。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。任務(wù)四 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點 氨基酸的-氨基和-羧基已經(jīng)用于形成肽鍵了，但在N末端

52、和C末端還有游離的氨基和羧基，可發(fā)生解離。可解離基團主要來自于氨基酸側(cè)鏈。很多氨基酸的側(cè)鏈有可解離基團，其中有些可以進(jìn)行酸性解離，如Asp和Glu的側(cè)鏈羧基，Tyr的酚羥基，Cys的巰基；有些能進(jìn)行堿性解離，如Lys的側(cè)鏈氨基，Arg的胍基，His的咪唑基。如果是結(jié)合蛋白質(zhì)，則輔基中可能也含有可解離基團。 一般情況下，pH低，有利于堿性解離，蛋白質(zhì)中正電荷增加而負(fù)電荷減少，帶正電荷。pH高，則有利于酸性解離，蛋白質(zhì)中正電荷減少而負(fù)電荷增加，帶負(fù)電荷。解離情況如下： 當(dāng)pH=pI時，蛋白質(zhì)以兩性離子形式存在，當(dāng)pHpI時，蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在略偏酸性的范圍內(nèi)，這主要是由于羧基

53、的解離度大于氨基的解離度。 一般情況下，酸性氨基酸含量越高，蛋白質(zhì)pI就越低，堿性氨基酸含量越高，pI就越高。具有可解離的氨基酸位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，參與氫鍵、鹽鍵的形成 以及穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，這些氨基酸就不會影響蛋白質(zhì)表面的帶電特性，對蛋白質(zhì)的pI沒有貢獻(xiàn)。 如肌紅蛋白中就有5個His殘基分布在分子內(nèi)部，雖然它們都是堿性氨基酸，但不影響肌紅蛋白的pI。蛋白質(zhì)的pI與酸性氨基酸、堿性氨基酸的比例沒有必然的數(shù)量關(guān)系。 蛋白質(zhì)pI并非蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)，受溶液中鹽種類和濃度等影響。在純水中不受其它離子干擾時，使蛋白質(zhì)帶正負(fù)電荷相等的pH稱為等離子點，等離子點是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。由于蛋白質(zhì)總是處于含有

54、離子的溶液環(huán)境中，所以人們通常討論的都是蛋白質(zhì)的等電點。 在等電點時，蛋白質(zhì)的各種物理性質(zhì)，如溶解度、導(dǎo)電性、黏度都達(dá)到最小值。等電點時蛋白質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥力消失，雙電層被破壞，分子間容易發(fā)生聚集而沉淀。二、蛋白質(zhì)的膠體作用 分散介質(zhì)在1-100nm之間稱為膠體溶液，這是在一條件下能夠保持穩(wěn)定的分散系統(tǒng)。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大多在1萬-100萬之間，分子大小屬于膠體粒子的范圍，因此，蛋白質(zhì)溶液為膠體溶液，表現(xiàn)出很多膠體性質(zhì)，如丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運動，不能透過半透膜。 蛋白質(zhì)膠體溶液要保持穩(wěn)定需具備兩個因素：分子表面帶同種電荷和分子表面形成水化層。 蛋白質(zhì)親水膠體，疏水氨基酸分布在分子內(nèi)部，

55、親水氨基酸則分布在分子表面，親水氨基酸和水分子之間以氫鍵連接，構(gòu)成了蛋白質(zhì)的結(jié)合水。大量親水氨基酸的存在，使1g蛋白質(zhì)可結(jié)合0.3-0.5g水，蛋白質(zhì)表面水化層能有效防止蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集。三、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 天然蛋白質(zhì)受到某些理化因素的作用，有序的空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致生物活性喪失，并伴隨發(fā)生理化性質(zhì)的異常變化，稱為變性作用。蛋白質(zhì)的變性作用涉及蛋白質(zhì)二級、三級、四級結(jié)構(gòu)的喪失，但一級結(jié)構(gòu)仍保持不變，肽鍵不發(fā)生斷裂，所以蛋白質(zhì)變性前后分子量沒有變化。蛋白質(zhì)變性因素可以分為物理因素和化學(xué)因素：（1）物理因素：如加熱、UV、超聲波、X-ray、高壓、表面張力、劇烈振蕩、攪拌、研磨等。（2）化

56、學(xué)因素：酸、堿、有機溶劑、重金屬鹽、變性劑、去污劑、生物堿試劑。 變性蛋白與天然蛋白在很多性質(zhì)上會有區(qū)別，主要表現(xiàn)在：（1）理化性質(zhì)的改變。變性蛋白由于疏水基團的外露，溶解度降低，因此，變性過程常伴隨蛋白質(zhì)的沉淀。同時，蛋白質(zhì)溶液黏度增加，旋光性變化，等電點有所提高。由于Trp、Tyr和Phe外露，蛋白質(zhì)的紫外吸收值增加。（2）生物活性喪失。這是蛋白質(zhì)發(fā)生變性的最重要的標(biāo)志。（3）生物化學(xué)性質(zhì)的改變。主要反映在變性后分子結(jié)構(gòu)松散，容易被蛋白酶所水解，熟食易于消化就是這個道理。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用 蛋白質(zhì)穩(wěn)定需滿足帶同種電荷和形成水化層兩個條件。破壞蛋白質(zhì)表面電荷或水化層，穩(wěn)定性就會下降，發(fā)生絮

57、結(jié)沉淀，這就是蛋白質(zhì)的沉淀作用。沉淀作用與蛋白質(zhì)變性作用是有區(qū)別的，發(fā)生沉淀作用時，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)仍保持原狀，仍具有生物學(xué)活性，若恢復(fù)到原來的條件，蛋白質(zhì)可重新溶解。 常用沉淀方法有等電點沉淀、鹽析法、有機溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿試劑和某些酸類沉淀法以及熱變性沉淀法等。（1）鹽析法 在鹽濃度很低時，向蛋白質(zhì)溶液中加入少量的中性鹽（如NaCl、KCl、硫酸銨、硫酸鈉等），蛋白質(zhì)溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶，當(dāng)加入大量的中性鹽后，蛋白質(zhì)溶解度下降并發(fā)生絮結(jié)沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶現(xiàn)象是由于少量中性鹽有利于雙電層的形成，增加了蛋白質(zhì)和水的親和力，促進(jìn)了蛋白質(zhì)溶解。而鹽析現(xiàn)象的發(fā)生是由于高濃度的鹽結(jié)合了大量水，破壞了水化層，加強了蛋白質(zhì)間直接作用。鹽析法是最常用的沉淀蛋白質(zhì)的方法，不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。 案例：硫酸銨分級鹽析分離血清中的主要蛋白質(zhì)1、取100ml血漿或血清置于500ml燒杯中，加PBS（phosphate buffer saline）100ml攪拌10min。2、在攪拌下慢慢滴加200mlpH7.2飽和硫酸銨溶液。3、加完飽和硫酸銨溶液后繼續(xù)攪拌2030min以充分沉淀球蛋白。4、離心（3500r/min）2