肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案

1、原代培養(yǎng)肝細(xì)胞是肝細(xì)胞移植、生物人工肝的最正確生物材料。長期以來,國外眾多學(xué)者對肝細(xì)胞別離方法、培養(yǎng)條件進(jìn)展了大量的研究,但要獲得高活率、功能好的肝細(xì)胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法別離肝細(xì)胞,包括機(jī)械法（如勻漿法）及螯合法。機(jī)械法對肝細(xì)胞損傷大,細(xì)胞活率低;螯合法是用可結(jié)合Ca2+、Mg2+的螯合劑 TOC o 1-5 h z （如枸櫞酸鹽或EDTA）別離肝細(xì)胞,但螯合劑單獨(dú)使用效果不好,常需與酶法結(jié)合使用。后期逐漸改為酶消化法別離肝細(xì)胞,包括膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者對酶濃度及作用時(shí)間要求十分嚴(yán)格,且由于胰蛋白酶是一種強(qiáng)蛋白質(zhì)消化酶,對肝細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重,因而易造成肝細(xì)胞死亡,導(dǎo)致

2、別離失敗。膠原酶消化法對肝細(xì)胞損傷較小,雖然肝細(xì)胞膜在消化過程中也會受到損害,但經(jīng)培養(yǎng)后可完全修復(fù)。膠原酶在消化肝的同時(shí)解除了細(xì)胞間接觸抑制或活化了潛在的蛋白激酶、生長因子或受體,使肝細(xì)胞能逐漸適應(yīng)消化別離過程中所發(fā)生的細(xì)胞、外環(huán)境及細(xì)胞間的各種改變。這些改變對離體肝細(xì)胞修復(fù)、生長及其功能有重要的促進(jìn)作用,有利于肝細(xì)胞的培養(yǎng)。這種適應(yīng)性改變恰恰是機(jī)械別離法所沒有的。因此,要獲取理想的肝細(xì)胞,酶消化這一重要環(huán)節(jié)不可缺少。Seglen二步灌注法為經(jīng)典的膠原酶消化法,但所需設(shè)備較復(fù)雜,膠原酶消耗量大。本研究在其根底上略加改良。作者認(rèn)為,采用膠原酶消化法,膠原酶的用量、作用時(shí)間及作用條件是別離成功與否

3、的關(guān)鍵。膠原酶的濃度過高,作用時(shí)間難以控制;濃度過低,那么作用時(shí)間過長、細(xì)胞活率降低。事先用無Ca2+、Mg2+的灌注液進(jìn)展預(yù)灌注，去除Ca2+依賴性粘附因子，使橋粒斷裂；然后用含Ca2+的膠原酶消化，膠原酶的作用需要Ca2+的活化,在5mmol/LCa2+濃度下,用濃度為500mg/L的膠原酶37條件下消化15min最正確。在進(jìn)展肝細(xì)胞洗滌、離心、重懸等純化操作時(shí),溫度需保持在。4C。肝細(xì)胞別離時(shí),pH值宜維持在7.4左右,不低于7.2,最高不超過7.6,否那么將對肝細(xì)胞造成很大損傷。在肝灌注液中參加適量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以維持細(xì)胞代和液體滲透壓,提高肝細(xì)胞成活率。此外,門靜脈插

4、管應(yīng)迅速置入,灌注速度必須保持一致。培養(yǎng)板預(yù)處理及培養(yǎng)液選擇采用鋪過膠原的新培養(yǎng)板與沒有鋪過膠原的新培養(yǎng)板,鋪過膠原的老培養(yǎng)板培養(yǎng)肝細(xì)胞比擬,發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞在鋪過膠原的新培養(yǎng)板中長勢更好。新的培養(yǎng)板使用Sigm泌司提供的膠原鋪膠,置于37恒溫箱中過夜后使用。過去選擇含8%胎牛血清的WE作培養(yǎng)基，效果不錯(cuò)，但WE價(jià)格昂貴，我們試著采用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基,并在其中參加胰島素,地塞米松等生長因子,肝細(xì)胞生長好。肝細(xì)胞的接種密度對其以后的生長狀況有很大的影響:密度太小,細(xì)胞不易生長;密度太大,肝細(xì)胞增殖受到抑制,培養(yǎng)板中缺少足夠的空間供細(xì)胞伸展。當(dāng)細(xì)胞密度為5X105/ml左右時(shí),試劑

5、及儀器主要試劑：胰島素、高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、地塞米松、IV型膠原酶、錐蟲藍(lán)等購自美國Sigma公司。鼠尾膠為自行配制。WilliamsE培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。BT01-100蠕動泵（格蘭蠕動泵）、Sorvall低溫離心機(jī)（美國Kendro公司）,CL-800全自動生化分化儀（日本島津）,XD-101倒置顯微鏡（光學(xué)顯微鏡公司）。HeraeusCO2孵箱（美國Kendro公司）,KT-902干凈室（康達(dá)凈化空調(diào)設(shè)備廠）。實(shí)驗(yàn)步驟：一、原代大鼠肝細(xì)胞的別離1.實(shí)驗(yàn)動物Spragure-DawleySD大鼠購自醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。雄性，清潔級，體重150200g812

6、周齡。分籠飼養(yǎng)，喂飼標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料，隨意飲水，保持室溫20C25C。2.主要儀器設(shè)備：倒置相差顯微鏡；自動平衡微型離心機(jī)：LDZ4-0.8醫(yī)用離心機(jī)廠；套管針；超凈工作臺；電子分析天平；外科手術(shù)器械3主要試劑及藥品：IV型膠原酶；RPMI164嘴養(yǎng)基；胎牛血清；臺盼藍(lán)；Percol刷離液；PBSS沖液；青霉素80萬U及鏈霉素100萬U胰島素、高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、地塞米松4.具體實(shí)驗(yàn)步驟：SD大鼠，氯胺酮80mg/kg腹腔麻醉同時(shí)腹腔注射1000U肝素鈉注射液抗凝固定大鼠仰臥位于超凈工作臺上用前紫外燈照射超凈臺半小時(shí)，剪去胸腹部體毛，碘伏胸腹部皮膚消毒后，帶無菌手套，鋪洞巾，取腹部

7、正中切口，可見鮮紅的肝臟，暴露出門靜脈和肝下下腔靜脈，用彎頭鉗子鈍性別離門靜脈和下腔靜脈，并在各靜脈下放置1根4零細(xì)線，暫不結(jié)扎，用套管針以約15角在門靜脈遠(yuǎn)端向近端平行刺入注意針頭刺入在距離門靜脈3個(gè)分支處0.5cm,刺入過深勢必影響灌注效果.細(xì)線結(jié)扎后以封閉門靜脈遠(yuǎn)端，再退出金屬針心，并將套管針連接一次輸液器一端，另一端接上輸液瓶預(yù)熱灌流液的輸液瓶用保溫套保持溫度以防止溫度下降過快以影響酶的消化活性輸液瓶高度距離灌流大鼠肝臟120cm翻開輸液器輸鈕將預(yù)熱至37無鈣灌流液200mL經(jīng)一次性輸液管道及連接其末端的套管針流入門靜脈，控制流速約20mL/min；另一套管針頭立即插入肝下下腔靜脈，細(xì)

8、線結(jié)扎固定以防針頭由下腔靜脈脫出并退出金屬針心，讓血液和灌流液從下腔靜脈流出，用無菌平皿接流出液，保持流出端無菌，同時(shí)翻開胸腔結(jié)扎肝上下腔靜脈，數(shù)分鐘后肝臟逐漸腫脹變淡黃色直到下腔靜脈流出液顏色接近無鈣灌流液.約510min,改輸預(yù)熱至37C的0.05%IV型膠原酶灌流液100mL繼續(xù)灌流，更換流出端的平皿，以回收膠原酶以循環(huán)使用，控制約10mL/min.灌流持續(xù)約510min,0.05%IV型膠原酶灌流過程中，取一根無菌濕棉簽輕輕壓迫肝臟外表，以判斷肝臟消化的程度，待壓迫肝臟后不再回縮外表出現(xiàn)滲出、肝包膜下組織呈龜背狀裂隙時(shí)判斷肝臟已被消化充分，可以終止灌流。離斷肝臟血管、韌帶及系膜，將肝臟

9、完整取下注意不要碰破胃腸組織，防止造成污染，置于無菌平皿。用眼科鑷鈍性撕裂肝組織，4RPMI1640完全培養(yǎng)基終止IV型膠原酶的消化作用，裝入無菌100mL三角燒瓶置搖床上，100r/min，搖10min，所得的肝細(xì)胞懸液經(jīng)三層無菌紗布過濾，以除去一些大的細(xì)胞團(tuán)塊及被膜組織，再裝入50mL離心管，500r/min,離心3min,棄上清，以4cRPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，反復(fù)離心3次，以除去血細(xì)胞、肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及一些細(xì)胞碎片和少量的結(jié)締組織。離心之后得到的肝細(xì)胞沉淀以含4RPMI1640完全培養(yǎng)基對細(xì)胞沉淀進(jìn)展重懸，用吸管輕輕反復(fù)吹打肝細(xì)胞懸液使肝細(xì)胞重懸均勻后即制備成肝細(xì)胞懸液。二、原代

10、大鼠肝細(xì)胞的純化取無菌的50mL離心管置管架上，用彎頭吸管沿管壁小心地將肝細(xì)胞懸液和75%Percoll別離液按1:1鋪層，底層為75%Percoll別離液肝細(xì)胞懸液鋪加于上層，盡量減少震蕩，4C,800r/min,10min離心后，離心管液體分四層，頂層為死細(xì)胞，第二層為混合肝細(xì)胞，第三層為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，底層為別離液取第三層肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞用于重懸制成肝細(xì)胞懸液外，另吸取第二層混合肝細(xì)胞，加PBS液稀釋，再次小心依次按1:1:1分鋪底層50%Percoll、中層25%Percoll、頂層混合肝細(xì)胞懸液，盡量減少震蕩，4，800r/min，10min離心，底層沉淀為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，吸除上層液，用完全培養(yǎng)基重懸底層沉淀的肝細(xì)胞制成肝細(xì)胞懸液取肝細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)溶液混勻后1min滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。三、肝細(xì)胞原代培養(yǎng)詳細(xì)步驟RPMI164猶全培養(yǎng)基（100mL!_1胎牛血清RPMI1640W養(yǎng)基培養(yǎng)基、青霉素105UI-L1、鏈霉素100mcg-L1和胰島素160U-1）調(diào)整肝細(xì)胞懸液細(xì)胞密度，按每孔1X106個(gè)細(xì)胞接種于鋪有肝細(xì)胞懸液的6孔培