菌落PCR轉(zhuǎn)化子的篩選課件

1、轉(zhuǎn)化子的篩選 菌落PCR 第1頁，共16頁。DNA克隆的過程獲得目的DNA片斷 (提取質(zhì)粒DNA、PCR、酶切）載體DNA與目的基因連接轉(zhuǎn)化受體細胞篩選轉(zhuǎn)化子表達目的基因 第2頁，共16頁。連接反應(yīng)后，可形成多種類型的DNA分子1.不帶外源DNA的載體自連分子2.外源DNA彼此相連的多聚DNA分子3.載體與外源DNA相連的分子通過篩選鑒定： 1.有沒有外源DNA 2.外源DNA的連接方式是否正確第3頁，共16頁。重組子篩選方法遺傳檢測法物理檢測法菌落原位雜交法免疫化學(xué)檢測法測序菌落PCR第4頁，共16頁。遺傳檢測法 （1）抗藥性記號插入失活選擇法 第5頁，共16頁。（2） -半乳糖苷酶顯色法篩

2、選重組子 第6頁，共16頁。 菌落原位雜交第7頁，共16頁。提取質(zhì)粒酶切法需要提取質(zhì)粒,當(dāng)篩選的樣品較多時,操作比較繁瑣； 藍白斑篩選法需要載體有特殊結(jié)構(gòu); 雜交篩選法除操作比較復(fù)雜外,尚需使用同位素;插入失活法僅適用于個別載體。本次實驗中抗性平板上生長菌落數(shù)量眾多，采用一種快速、簡便的篩選方法菌落PCR 第8頁，共16頁。菌落PCR ：是直接以轉(zhuǎn)化菌的單個克隆為模板,通過特異性引物或通用引物對插入載體中的目的基因快速擴增，用于鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的技術(shù)。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比,由于其具有快速、經(jīng)濟、簡便的特點而被廣泛用于轉(zhuǎn)化菌、特別是大量轉(zhuǎn)化子的鑒定和篩選 。第9頁，共16頁。第10頁，共16

3、頁。操作步驟在PCR管中加7.5L無菌水。為平板上將要挑取的菌落標上號碼（每組挑取8個菌落），用無菌牙簽挑選單菌落，將菌落轉(zhuǎn)至PCR管中（牙簽在無菌水中洗一下），然后將牙簽點在LB(+Amp)平板，記錄號碼。在PCR管中加7.5L PCR pre-Mix（已配好）設(shè)定PCR程序，開始PCR。電泳檢測。LB平板過夜培養(yǎng)，選取正確的菌落。第11頁，共16頁。菌落PCR和常規(guī)PCR的比較 菌落PCR： 常規(guī)PCR： 94 10min 94 5min 94 40s 94 40s 62 32s 58 32s 72 90s 72 90s 3035 cycle 3540 cycle 72 7min 72 7

4、min 4 for ever 4 for ever第12頁，共16頁。前變性94時間延長為10 min, 使得細菌能夠充分破裂,DNA 大量釋放并充分變性。退火溫度由 58 提高到62 是由于原來引物中的酶切位點和保護堿基與待擴增的基因是不配對的，現(xiàn)在配對的數(shù)量增多，退火溫度越高,特異性越強 。循環(huán)次數(shù)減少是因為2535個循環(huán)的擴增量足夠進行檢測，如果量太大跑出的電泳條帶呈現(xiàn)型，不易確定分子量。第13頁，共16頁。菌落PCR出現(xiàn)假陽性 轉(zhuǎn)化時未進入菌體內(nèi)的小片段DNA存在于受體菌上或涂濺在抗性平板菌落周邊上。樣品污染、擴增試劑污染、擴增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、 試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西。菌落PCR出現(xiàn)假陰性 避免將瓊脂培養(yǎng)基挑到PCR管中及其他原因:酶失活；引物質(zhì)量不好（設(shè)計、合成、保存）；物理原因（變性、退火的溫度、時間）。 第14頁，共16頁。一般重組子克隆的PCR反應(yīng)條帶比較亮且寬,形狀較規(guī)則,而假陽性和假陰性的PCR條帶,多數(shù)不太亮,條帶細而且不規(guī)則,有時拖尾設(shè)陰性對照第15頁，共