蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析精選課件

1、第二章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析第1頁，共28頁。第一節(jié) 蛋白質(zhì)樣品的準備 進行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品，一般要求純度95。這樣的樣品，通常是用色譜和電泳精制過的。一、SDSPAGE純化的樣品 從SDS上分離的蛋白質(zhì)必需經(jīng)過特殊處理，使SDS濃度低于0.0005，否則SDS會影響到胰蛋白酶的酶解，也會大大降低HPLC分肽時的分辨率。有報道指出，在2molL尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)時，如果SDS濃度0.05，則完全阻止了胰蛋白酶和內(nèi)肽酶Lys-C的作用。 雖然有報道用HPLC或用鹽酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共價結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS分子更難除去。 在SDS后，采用電印跡(blottin

2、g)到PVDF膜上，也是常用的方法，因為PVDF膜結(jié)合蛋白質(zhì)能力的專一性遠遠超過其結(jié)合鹽、氨基酸和去垢劑，因此，蛋白質(zhì)能和這些“污染物”分開。經(jīng)過這樣處理后，能用于BrCN化學裂解或酶解。第2頁，共28頁。二、HPLC純化的樣品 如果樣品是用反相HPLC純化的，因為流動相是揮發(fā)性溶劑，它們在真空離心干燥或凍干樣品時除去；如果蛋白質(zhì)是用離子交換HPLC或疏水HPLC或凝膠過濾HPLC精制的，則樣品要進行脫鹽。 脫鹽或稀蛋白溶液的濃縮可用0.1三氟乙酸(TFA)乙腈(ACN)系統(tǒng)的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因為蛋白質(zhì)是水溶性的，所以先用能與水互溶的甲醇或乙腈(2ml)潤之，

3、再用5ml純水洗滌；然后樣品液體通過Sep-Pak柱時，蛋白質(zhì)保留在柱上，小分子的鹽類流過柱體，用水溶液充分洗滌后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白質(zhì)。 小的超濾裝置對濃縮蛋白質(zhì)也是有效的。此外，有機溶劑或TCA沉淀也可以考慮。三、蛋白質(zhì)樣品中的二硫鍵和巰基(一SH) 當?shù)鞍踪|(zhì)樣品純度達到要求，鹽和小分子也除得比較“干凈”，在進行酶解前，還要轉(zhuǎn)變半胱氨酸殘基成其他的穩(wěn)定的衍生物。因為半胱氨酸的巰基在分肽過程中易自動氧化成各種產(chǎn)物，包括形成無序的二硫鍵，因此需要將半胱氨酸殘基先轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的衍生物。 常用有碘代乙酸烷化，因為這個反應(yīng)是快速和專一的；同時這類試劑保存在暗處是很穩(wěn)定的。而且，這類試劑的矯作物(

4、artifact)容易得到放射性標記物。蛋白質(zhì)或肽在導(dǎo)入帶電荷基團后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在還原后再修飾。第3頁，共28頁。1還原和羧甲基化 將1 20mg蛋白質(zhì)溶解在含6mol/L鹽酸胍的0.1mol/LTris-1mmol/LEDTA的緩沖液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些(過量于存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵)，通氮氣，然后迅速封閉，37反應(yīng)1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量為1.1倍(分子比)過量于溶液中的巰基數(shù)(蛋白質(zhì)中的一SH和DTT中的一SH總和),典型為4.55mmol/L，再次充氮氣，于暗處37保溫1h。加2巰基乙醇至

5、最后濃度1(V/V)結(jié)束反應(yīng)，然后對50mmol/LNH4HC03，含0.01硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，凍干。 注意：碘代乙酸必須是無色的，如果有碘存在，呈淡黃色，會引起巰基迅速氧化，阻礙了烷化反應(yīng)，而且可能有副反應(yīng)，使色氨酸修飾。 碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸殘基的烷化。這常用于避免牛胱氨酸被導(dǎo)入負電荷，而用中性的碘代乙酰胺。另一種情況是變性劑不用鹽酸胍，而用SDS，這時如果用碘代乙酸，反應(yīng)往往進行得很慢，而且不完全，這是因為碘代乙酸的負電荷和蛋白質(zhì)SDS膠束(微團)上的負電荷相互排斥。 2還原和吡啶乙烯化 用4乙烯吡啶(4-vin

6、ylpyridine)處理同上，通氮氣保溫過夜。第4頁，共28頁。第二節(jié) 蛋白質(zhì)的化學裂解 裂解于甲硫氨酸(Met) 溴化氰(BrCN)是首選的化學試劑，專一裂解在甲硫氨酸的羧基端，對多數(shù)蛋白質(zhì)裂解效率為90以上。BrCN在酸性條件下，裂解在甲硫氨酸的C端肽鍵上，將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成高絲氨酸()(homoserine)和高絲氨酸內(nèi)酯(I)(homoserinelactone)的混合物，它們之間也能相互轉(zhuǎn)化，如圖2.1所示。第5頁，共28頁。 對Met-Thr、Met-Ser鍵，則常常是低產(chǎn)率的，可能是羥基產(chǎn)生下面的一系列反應(yīng)(和)，最后形成高絲氨酸殘基(V)，而未裂解此肽鍵，如圖2.2所示。Met

7、-Cys鍵也不易裂解。第6頁，共28頁。 典型的反應(yīng)常常在20、70甲酸(V/V)中進行24h，副反應(yīng)是部分Asp-Pro鍵會斷裂，一些酰胺基團會部分丟失，部分Asn-Gly會產(chǎn)生重排或環(huán)化，有時Trp會氧化。 操作：蛋白質(zhì)先用5巰基乙醇在pH 8.0室溫下處理24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸計算)以防止色氨酸氧化。 蛋白質(zhì)以15mg/ml濃度溶解在70甲酸中，加入50倍過量，小體積的BrCN/70甲酸，通氮并置于暗處，室溫放置1624h，結(jié)束后加15倍體積的水，凍干，重復(fù)加水凍干。第7頁，共28頁。第8頁，共28頁。第三節(jié) 蛋白水解酶酶解一

8、、 常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶(trypsin) 專一作用在Arg和Lys(堿性氨基酸)的羧基端，但對Arg-Pro和Lys-Pro鍵沒作用。 我們常將胰蛋白酶配成1mg/ml，貯存在1mmol/LHCl中，-20保存數(shù)月，而未觀察到酶的活性損失。如果樣品溶解度差，可適量加入尿素增加溶解度，因為胰蛋白酶在2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶(-chymotrypsin) 專一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)內(nèi)肽酶Lys-C(endoproteinase Lys-c) 專一作用在Lys的羧基端。(4)V8蛋白酶(staphylococcal protease) 專一作用在

9、Asp和Glu(酸性氨基酸)的羧基端。pH 8.0的磷酸緩沖液時，作用在Glu-X和Asp-X；pH 4.0的乙酸緩沖液時，僅作用于Glu-x鍵。第9頁，共28頁。(5)梭菌蛋白酶(clostripain) 專一作用在Arg的羧基端。(6)凝血酶(thrombin) 專一裂解在Arg-Gly鍵上，在纖維蛋白原工作中，很大程度上還依賴于鄰近氨基酸序列。近來還常用作融合蛋白的裂解點。(7)其他 還有專一性較廣的胃蛋白酶(pepsin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶(papain)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)等。 應(yīng)該指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均從胰臟制備，常常不易

10、完全分開，而是你中有我，我中有你，專一性不佳，易造成混亂。應(yīng)采購TPCK胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活性)和TLCK胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白-酶活性，才能保證酶的專一性。第10頁，共28頁。二、 酶解操作條件 將30l(100g)蛋白質(zhì)，100mmol/L NH4HCO3，pH 8.5，5mmol/L DTT，50作用15min，在冷至室溫后，加5l 100mmol/L碘代乙酸，室溫15min，加60l水，最后加酶5l蛋白樣品:酶=25:1(質(zhì)量比)，37保溫20-24h，凍干樣品或直接注射樣品(用稀TFA酸化至約pH 2.5)到反相HPLC柱中分析。第11頁，共28頁。三、 討 論(1)蛋

11、白質(zhì)的量和濃度 酶解不能正常進行的主要原因之一是蛋白質(zhì)的量不足。精確定量蛋白質(zhì)是必需的，一般用氨基酸分析來定量微量的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)濃度通常要求500g/ml，最少不得低于100g/ml，否則酶的消化難以進行，體積在50100l。(2)緩沖液、鹽和去垢劑 酶作用可以被緩沖液中的各種因子所抑制或完全阻止。在標準的2mol/L尿素，0.1mol/L NH4HCO3系統(tǒng)中，SDS含量為0.0005時，就會影響酶的消化。0.005SDS會減少許多酶解肽段的產(chǎn)量。類似的，染料考馬斯蘭和兩性電介質(zhì)也會阻止酶的消化。高濃度的鹽(1mol/L NaCl)也會影響蛋白水解酶的活性；2mol/L以上濃度的尿素會影

12、響羧甲基化和蛋白酶的消化。(3)羧甲基化 Stone等報道，轉(zhuǎn)鐵蛋白用酶解時，羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解很好，而沒有羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白，酶解程度很差。第12頁，共28頁。(4)蛋白酶的量 酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:25，如果分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(6萬Da)，則比例要減低至1:50。胰蛋白酶要用序列級的商品。(5)原位酶解 將SDS上的蛋白質(zhì)樣品從凝膠上解析下來是很困難的，文獻報道有很多方法，但實用性差。目前流行的方法是將蛋白質(zhì)電印跡(blotting)至PVDF類的膜上，直接進行序列分析或直接在膜上進行酶解，后者稱為原位分析(in situ)。 第13頁，共28頁。 原位酶解操作如下：膜片剪成lmm細

13、條，放在Eppendrof管中,加1.2ml 0.5(m/V)PVP-40/0.1mol/L HAc，37保溫30min，PVP-40的作用是阻止在酶解時蛋白酶吸附到硝酸纖維素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗滌膜至少5次以洗凈殘留的PVP-40(因為PVP-40有很強的紫外吸收，在RP-HPLC中，PVP-40于30一40有機溶劑濃度時洗下來，它在215220nm有很高的吸收，在260289nm吸收很小)，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解時的緩沖液漂洗，然后進行酶解，一般蛋白酶在100mmol/L NH4HCO3:CAN =95:5，pH8.2，37酶解過夜，對V8蛋白酶則在100

14、mmol/L磷酸鈉:ACN=95:5，pH 7.8，室溫過夜。酶與底物之比為1:10至1:20(質(zhì)量比)；對亞微克級樣品，酶與底物之比高達2:1。酶解后-20保存或立刻用數(shù)微升10TFA酸化，上樣到HPLC柱上分析。第14頁，共28頁。(6)限制性酶解 限制性酶解有助于蛋白質(zhì)測序時的序列演繹。最著名的例子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草桿菌蛋白水解酶在pH 8.0下作用，活性沒有變化，但出現(xiàn)一個新的N端絲氨酸。用AmberliteIRC-50離子交換柱，0.2mol/L pH6.25的磷酸鈉緩沖液可分離到一個大片段(S蛋白)和一個小片段(S肽)。也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S

15、蛋白，上層液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。第15頁，共28頁。第四節(jié) 蛋白質(zhì)中存在著封閉的N端 有些蛋白質(zhì)的N端是封閉的，尤其在腹水細胞中，80的蛋白質(zhì)的N端是乙?；?，因此用Edman法不能直接測定其序列，要用一系列的化學或酶處理。 如果在蛋白質(zhì)/肽序列儀上測定不到序列，蛋白質(zhì)的量肯定又是足夠的，則可在儀器上進一步用含水TFA(三氟乙酸)處理樣品，使蛋白質(zhì)酸水解成許多肽段后再測序，這時會有很多PTH-氨基酸出現(xiàn)，以此反證此蛋白質(zhì)的N端是封閉著的，再用下述方法除去封閉著的N端。 首先，用溫和的酸處理可以除去甲?；募琢虬彼?f-Met)，也可能引起絲氨酸、蘇氨酸的乙?；疦-O

16、重排反應(yīng)。如果酸處理后還是測不到序列，則進一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白質(zhì)N端上的焦谷?；?；假設(shè)這一方法仍不見效，再用較強的酸處理或其他酶處理。雖然有乙酰氨基酸釋放酶(acylaminoacid-releasing enzyme，AARE)，但它不能作用長度在20個氨基酸殘基以上的蛋白質(zhì)或肽。因此，封閉的蛋白質(zhì)首先裂解成小肽，再用AARE處理除去N端上的乙?；被徂D(zhuǎn)變成n-1肽，然后n-1肽的序列再用Edman法測定。第16頁，共28頁。一、除去蛋白質(zhì)中封閉的N-乙酰絲氨酸和N-乙酰蘇氨酸 樣品置于1.5ml的聚丙烯離心管中，加無水TFA，密閉，40保溫1h，然后打開管蓋，讓TFA揮發(fā)，干燥，

17、再進行序列分析。二、除去N-甲酰甲硫氨酸 樣品置于1.5ml聚丙烯離心管中，加30l 0.6mol/L HCl，密閉，25水解24h，打開管蓋，真空除去HCl，然后進行序列分析。 以上兩種溫和酸水解除去甲?；蛞阴０被?，這與時間、溫度、酶濃度有很大關(guān)系，過分的酸水解會引起蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，如對酸不穩(wěn)定的Asp-Pro鍵；相反，條件不夠，則封閉的N端基團水解不完全，導(dǎo)致測序的起始點不均一。三、除去N端的焦谷氨酸殘基(pyroglutamate) 樣品在序列儀上測不出N端，則將載有樣品的膜片轉(zhuǎn)移至1.5ml聚丙烯微量離心管中，用0.5PVP-40洗膜片(見上節(jié)原位酶解部分)，再加100l焦谷氨酸

18、氨肽酶(5g于50mmol/L磷酸鈉pH7.0，含10mmol/L DTT)37酶解510h，用水洗膜，干燥，放回序列儀分析。第17頁，共28頁。五、選擇性純化N端封閉的肽 蛋白質(zhì)用胃蛋白酶(pepsin)或嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)作用后(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上強酸性陽離子交換柱(例Dowex 50mmX2mm，H+型)。所有含游離氨基或其他堿性基團的肽都結(jié)合至柱上，僅缺少堿性基團的肽通過柱泄出。如果N端是封閉著的(沒有游離的N端氨基)，同時因用專一性很廣的酶作用，肽較小又不含組氨酸、賴氨酸、精氨酸則可在排出液中發(fā)現(xiàn)N端封閉的肽。 此技術(shù)的局限性是：大肽(甚至含有

19、堿性基團)可能不結(jié)合到樹脂上，因為它們不滲入樹脂孔徑內(nèi)；相反，一些疏水的肽，特別含有色氨酸殘基，即是它們?nèi)鄙儆坞x的N端氨基，也可能結(jié)合到柱上。此外，如果存在堿性基團非?？拷麼端，胃蛋白酶作用不能除去，則該技術(shù)也不見效。 應(yīng)該指出，N端為谷氨酸的肽在極端pH下會環(huán)化而轉(zhuǎn)變成封閉，需加以小心。近年來，由于質(zhì)譜(MS)在生物樣品檢測中有了長足的發(fā)展，可用MS精確測定分子質(zhì)量的方法來判斷封閉的N端為何種基團。第18頁，共28頁。第五節(jié) 蛋白質(zhì)中的C端殘基的測定一、羧肽酶法 羧肽酶是最常用的方法，對一些小肽而言，C端有時最容易測定的，如胰蛋白酶酶解肽段時總是以Lys或Arg為C端；BrCN裂解的肽總是以

20、高絲氨酸(homoserlne)為C端；V8蛋白酶酶解的肽總以Glu或Asp為C端。雖然有非專一的情況，但畢竟出現(xiàn)的概率很少。 羧肽酶酶解是從C端開始，一個一個地從C端釋放出氨基酸殘基，這是個動態(tài)的釋放過程。有的氨基酸釋放快些，有的氨基酸釋放慢些。對小肽的C端序列測定問題不大，但對長肽的序列測定，由于對不同氨基酸殘基釋放的速度不同，對后面一些氨基酸的序列判斷，可能會出現(xiàn)錯誤。在這方面不如化學降解法。 C端序列分析是在酶解的不同時間間隔，取出一定量的反應(yīng)物停止反應(yīng)后，用氨基酸分析定量氨基酸來排列出其序列，近來用質(zhì)譜法測定C端序列。第19頁，共28頁。(1)羧肽酶A(CpA) 此酶釋放非極性氨基酸

21、速度快，釋放His、Thr、homoserine也很快，釋放Asp、Set、Met sulphone則緩慢，釋放Lys也較慢，但在高pH下則速度加快點；酸性氨基酸的釋放也較慢，對Pro和Arg基本上不起作用。倒數(shù)第二個氨基酸殘基影響水解速度，但對這一現(xiàn)象作一歸納或解釋是很困難的。 此外，如何保證CpA不污染有內(nèi)肽酶也是一個很重要的問題，通常用二異丙基磷酰氟(Diisopropylfluorophosphate，DFP)處理以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。CpA在低離子強度下是不溶性的，通常以懸液形式存放于4。使用前將酶懸浮在水中，離心除去上層液，上層液中可能含有游離的氨基酸，而沉淀部分溶于少量2mo

22、l/L NH4HCO3中，此CpA加到變性的底物蛋白質(zhì)中(10-100nmol，pH 8.5，0.2mol/L N-ethylnorpholine HAc)，酶和底物的分子比為1:100，如果底物在此緩沖液中不溶解，則可在1SDS(V/V)或6mol/L尿素中進行。有時加正亮氨酸(norleucine，1mol/mol蛋白質(zhì))為內(nèi)標。溶液在25保溫，隔0.5，1，4，16h，取一定量反應(yīng)液(1-5nmol)，加等體積1mol/L HAc停止酶作用，離心除去蛋白質(zhì)，上層液真空干燥，然后殘余物溶在氨基酸樣品緩沖液中進行氨基酸分析。以正亮氨酸作校正，同時有相同程序的空白對照。 如果在酶作用短時間后就

23、釋放出大量的氨基酸，則改用低的CpA濃度和作用短時間(5，10，20，60min)取樣；相反，如果只有少量氨基酸釋放，則可加大酶/底物的比例，或37作用更長的時間。第20頁，共28頁。 (2)羧肽酶B(CpB) 從蛋白質(zhì)/肽的C端釋放Lys和Arg，CpB存放在20時，非常穩(wěn)定。 (3)羧肽酶Y(CpY) 目前CpY有更廣泛的專一性和通用性，一般講它作用底物C端的疏水性氨基酸快些，作用于帶電荷的氨基酸慢些。此酶很穩(wěn)定，某些金屬離子(例如Cu2，Hg2)抑制酶活性。CpY制劑中可能污染有酵母蛋白酶A，這時可加胃蛋白酶抑制劑(pepstain)抑制，也可用EDTA抑制。CpY用量一般為底物的1/5

24、01/100，在25作用，于不同時間取反應(yīng)液酸化后分析游離的氨基酸。 (4)羧肽酶P(CpP) CpP是種酸性羧肽酶，它貯存在pH 5.5的50mmol/L吡啶醋酸緩沖液中，于-20，6個月內(nèi)非常穩(wěn)定。其作用于pH2.5的100mmol/L吡啶甲酸緩沖液中。第21頁，共28頁。二、 化學降解法 早年的化學降解法只能測定一個C端氨基酸，遠遠不能滿足需求。而羧肽酶法雖能測到35個序列，但這是一個動態(tài)演繹的方法，有可能錯判。十多年前，蛋白質(zhì)化學家就開始用類似Edman降解法從C端逐個測定氨基酸序列，每次國際蛋白質(zhì)會議都有報道，直到2019年才有商品儀器供應(yīng)。目前C端序列儀一般只能測定5個氨基酸殘基左

25、右(這和蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，有些可測到10個左右)，在nmol水平上；這與N端序列還有很大的差距(目前N端序列儀靈敏度在10pmol，可測到50個循環(huán))第22頁，共28頁。第六節(jié) 蛋白質(zhì)中一些特殊肽段的檢出 一、含巰基肽的分離純化和分析 巰基在蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用，因此含巰基肽段的鑒定是蛋白質(zhì)化 學不可缺少的部分。文獻上含Cys的肽常用同位素標記的碘代乙酸處理，羧甲基化，然后在HPLC肽譜分析時跟蹤有標記的肽段。鑒于用同位素在國內(nèi)不很方便，我們用4-乙烯吡啶標記蛋白質(zhì)中的半胱氨酸，酶解后的肽譜，除用214nm檢出外，同時還用254nm檢出，只有被4-乙烯吡啶修飾的肽在254nm才

26、有吸收，所以能方便地檢出。 第23頁，共28頁。二、 含芳香族氨基酸肽的分離純化和鑒定 (一)引 言 蛋白質(zhì)在280nm有特征性的高吸收，這主要是芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的貢獻。蛋白質(zhì)在酶解后的肽譜中，檢測波長不用280nm，而采用214-220nm，這是由于肽鍵的強吸收緣故。肽譜中不含芳香族氨基酸的肽，在280nm下，基本上沒有吸收峰，但含有色氨酸或酪氨酸的肽，則在280nm下卻表現(xiàn)出強的吸收峰。據(jù)此，我們可以辨別含芳香族氨基酸的肽。 此外，含芳香族氨基酸肽的二階微分光譜也和一般肽的二階微分光譜有明顯的差別。在堿性條件下(pH12.5)，Tyr離子化的二階微分光譜與Trp的二

27、階微分光譜完全不同，特別在260nm。但這樣的條件對酸性的HPLC反相柱顯然是不合適的。第24頁，共28頁。三、含Lys-肽的分離純化和鑒定 賴氨酸的-氨基可以和磷酸吡哆醛(PLP)形成Schiff堿，該衍生物在325rml有特殊的吸收，利用這一性質(zhì)可找出含有Lys殘基的肽段。 (一)引 言 蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基常常與生物活性密切有關(guān)。例如醛縮酶(ALD)中的Lys-227和同位素標記的磷酸二羥丙酮反應(yīng)后，經(jīng)NaBH4還原可以形成Schiff堿。此時酶分子上可測定到等克分子數(shù)的放射性，同時酶的催化活性喪失。 用同位素標記肽比較麻煩，Shapiro則發(fā)現(xiàn)醛縮酶中Lys-117和磷酸吡哆醛(PLP)反應(yīng)，并經(jīng)NaBH4還原也可以形成Schiff堿，酶活性受抑制，但修飾后的醛縮酶仍可和底物結(jié)合。由此推論Lys-107是一次要活性部位。 用PLP作用的優(yōu)點是避免用同位素，PLP修飾在Lys殘基上形成的肽，在325nm有一特殊吸收。因此，這種技術(shù)對制備和分離Lys-肽具有普遍意義。第25頁，共28頁。附錄一 微量蛋白質(zhì)實驗室注意事項 (1)環(huán)境 由于是微克級的操作，實驗室內(nèi)的溫度、灰塵、纖維、皮膚和頭皮屑都會影響結(jié)果。 (2)吸附 玻璃容器的表面吸附，由于量少，會使大部分物質(zhì)被吸在壁上在溶液中的量趨于零。 用透析袋，少