卷心菜中過(guò)氧化物酶熱穩(wěn)定性的初步研究

1、實(shí)驗(yàn)一卷心菜中過(guò)氧化物酶熱穩(wěn)定性的初步研究一、實(shí)驗(yàn)原理果蔬中的過(guò)氧化物酶（peroxidase）往往具有較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)果蔬進(jìn)行熱燙處理時(shí)，常以過(guò)氧化物酶是否失活作為熱燙是否充分的標(biāo)準(zhǔn)。許多研究表明果蔬中的過(guò)氧化物酶有熱穩(wěn)定和熱不穩(wěn)定兩部分。這兩部分的比例取決于果蔬的品種和熱燙處理的溫度。過(guò)氧化物酶催化的典型反應(yīng)為：HO+AH-A+2H0。2222AH是無(wú)色的還原性化合物，如果它經(jīng)過(guò)氧化轉(zhuǎn)變成有色的A,那么反應(yīng)體2系在特定波長(zhǎng)下的吸光值就會(huì)隨反應(yīng)進(jìn)行而增加。因此，可以用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化物酶的活力。二、試劑和儀器試劑：0.05mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0,含1.0mol/LNaCl（緩

2、沖液I）、O.lmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0（緩沖液II）、1%鄰苯二胺-乙醇溶液、0.3%過(guò)氧化氫溶液儀器：組織搗碎機(jī)、抽濾裝置、水浴鍋、721分光光度計(jì)（含比色皿）、秒表、常規(guī)玻璃儀器三、實(shí)驗(yàn)步驟1、從卷心菜中提取過(guò)氧化物酶125g卷心菜+125mL緩沖液I!均質(zhì)（20000rpm,2min）勻漿!抽濾液體!離心（8000rpm,15min，4C）殘?jiān)鼮V過(guò)液（粗酶液）2、過(guò)氧化物酶熱處理將從卷心菜中萃取得到的過(guò)氧化物酶粗酶液置于試管中。取適量酶液稀釋5倍左右，過(guò)濾后測(cè)定酶活。另取適量酶液分別置于已編號(hào)的試管中，將試管在60C水浴中保溫1min,然后移至85C水浴鍋中，分別處理0.5mi

3、n、lmin、1.5min、2min、3min、5min、7min和10min，然后立即將試管轉(zhuǎn)移至冰浴中，快速冷卻至0C。再取適量酶液分別置于已編號(hào)的試管中，并將試管在60C水浴中保溫lmin,然后在100C下分別處理15s、30s、45s、1min、1.5min、2min和3min，然后在冰浴中快速冷卻，測(cè)定殘余過(guò)氧化物酶活力。3、過(guò)氧化物酶活力測(cè)定如果熱處理后酶液中產(chǎn)生混濁，應(yīng)在比色前過(guò)濾去除沉淀。向比色皿中加入2.6mL緩沖液II,0.1mL鄰苯二胺-乙醇溶液，0.2mL過(guò)氧化氫溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即攪勻計(jì)時(shí)，在430nm下測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光值隨時(shí)間的變化?？瞻滓跃彌_液

4、代替酶液。根據(jù)吸光值變化情況調(diào)節(jié)加酶量，保持酶液和緩沖液體積之和恒定。四、數(shù)據(jù)記錄與處理1、粗酶液活力測(cè)定數(shù)據(jù)時(shí)間/S102030405060708090100110120吸光度0.1050.1870.2620.3420.4270.5080.5940.6820.7730.8670.9661.062用Excel處理數(shù)據(jù)，得到下圖，加酶量0.1mL，稀釋倍數(shù)為5（1mL原酶液+4mL蒸餾水）。由圖可知：直線的斜率為0.5198，也就是說(shuō)每分鐘吸光度值上升0.5198。由于稀釋倍數(shù)為5倍，加酶量為0.1mL，因此計(jì)算得出酶活力為0.5198x5O=25.99U/mL。2、85C熱處理后殘余酶活測(cè)定數(shù)

5、據(jù)熱處理時(shí)間不同的幾組樣品在不同稀釋倍數(shù)及加酶量條件下分別測(cè)定了消光值,如下表：熱處理消光值時(shí)間/s10203040506070809010011012085C0.5min0.0450.0880.1380.1880.2400.2930.3480.4050.4640.5230.5850.64985C1.0min0.0470.0910.1360.1810.2290.2780.3270.3790.4320.4860.5410.59985C1.5min0.0150.0320.0540.0750.0970.1190.1410.1650.1880.2110.2340.25985C2.0min0.0420.

6、0780.1170.1550.1930.2340.2750.3170.3610.4060.4520.49985C3.0min0.0060.0120.0180.0250.0310.0380.0440.0520.0590.0660.0740.08285C5.0min0.0040.0040.0050.0060.0080.0090.0110.0130.0150.0170.0190.02185C7.0min0.0040.0030.0040.0040.0040.0030.0040.0040.0040.0040.0040.00485C10.0min0.0030.0030.0030.0030.0030.003

7、0.0030.0030.0030.0030.0030.003數(shù)據(jù)處理如下圖:00.511.522.5時(shí)間(min)（85C,30秒，稀釋4倍，加酶量O.ImL）2J-J00.511.522.5時(shí)間(min)（85C,60秒，稀釋3倍，加酶量O.ImL）（85C,90秒，稀釋2倍，加酶量O.ImL）（85C,120秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）（85C，180秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）0.0250.02-鰹0.015-薈0.01-0.005-0-00.511.522.5時(shí)間(min)（85C,300秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）（85C,420秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）0.003

8、50.0030.0025鄴0.002薈0.0015y=0.0030=0.00000.0010.00050.51.52.5時(shí)間(min)（85C，600秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）3、100C熱處理后殘余酶活測(cè)定熱處理時(shí)間不同的幾組樣品在不同加酶量條件下分別測(cè)定了消光值，如下表:熱處理消光值時(shí)間/s102030405060708090100110120100C0.25min0.0820.1440.2080.2750.3430.4140.4870.5640.6430.7240.8090.897100C0.5min0.1350.1760.2230.2830.3410.4040.4690.5360

9、.6050.6750.7480.825100C0.75min0.0040.0080.0120.0170.0210.0240.0290.0330.0380.0430.0470.052100C1.0min0.0050.0080.0110.0140.0170.0210.0250.0280.0310.0340.0380.042100C1.5min0.0880.0930.0960.1000.1070.1090.1140.1170.1220.1270.1310.135100C2.0min0.0870.0910.0910.0920.0930.0940.0950.0990.0960.0980.0980.099

10、100C3.0min0.0980.0980.0970.0980.0980.0980.0990.0990.0990.0990.1000.100數(shù)據(jù)處理如下面一系列圖:00.511.522.5時(shí)間(min)（100C,15秒，稀釋4倍，加酶量0.1mL）00.511.522.5時(shí)間(min)（100C,30秒，稀釋3倍，加酶量0.1mL）（100C,45秒，稀釋2倍，加酶量0.1mL）（100C,60秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（100C，90秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）0.1050.1鰹0.095穆0.090.0850.08L00.511.52.5時(shí)間(min)（100C,120秒，稀釋

11、1倍，加酶量O.ImL）時(shí)間(min)（100C,180秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）4、酶活計(jì)算Excel處理數(shù)據(jù)熱處理?xiàng)l件酶液稀釋加酶量酶活相對(duì)殘余活相對(duì)殘余活所的斜率倍數(shù)/mL/U/mL力（）力對(duì)數(shù)0.5198無(wú)50.125.99100.02.0000.330385C熱處理0.540.113.21250.8351.7060.300585C熱處理130.19.01534.6861.4820.134185C熱處理1.520.12.68210.3191.01360.248885C熱處理2未0.10.24880.957-0.01910.041385C熱處理3未0.10.04130.1589-0

12、.79890.009885C熱處理5未0.10.00980.0377-1.42370.000285C熱處理7未0.10.00020.0000077-5.1140.000085C熱處理10未0.10.00000-0.4435100C熱處理0.2540.117.7468.2571.8340.3810100C熱處理0.530.111.4343.9781.6430.0261100C熱處理0.7520.10.5222.00850.30290.0201100C熱處理1未0.10.02010.0773-1.11180.0256100C熱處理1.5未0.10.02560.0985-1.00660.006910

13、0C熱處理2未0.10.00690.0265-1.5770.0013100C熱處理3未0.10.00130.00005002-4.30095、相對(duì)殘余活力一熱處理時(shí)間曲線和相對(duì)殘余活力對(duì)數(shù)一熱處理時(shí)間曲線在相對(duì)殘余活力一熱處理時(shí)間曲線中，最初的直線部分代表酶的熱不穩(wěn)定部分失活，中間曲線部分可以認(rèn)為是過(guò)渡區(qū)域，而最后的直線部分表示耐熱部分的失活，擬合最后平緩部分并延長(zhǎng)（取最后三個(gè)點(diǎn)）可以得出它與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)，由此可以估算出耐熱部分活力占酶的總活力的比例。曲線如下圖：由圖中可知，85C熱處理時(shí)，卷心菜中過(guò)氧化物酶耐熱部分所占比例約為-0.0397，而100C熱處理時(shí)，其比例僅占-0.0508.2-525150y=-0L636fix42.0279IT2=0.9T582-525