【學(xué)習(xí)課件】第8章-第1節(jié)-基因診斷(3-LMJ)

1、第八章 基因診斷與基因治療基因診斷（gene diagnosis）：從基因水平探測(cè)和分析疾病的起因?；蛑委煟╣ene therapy）：從基因水平干涉和矯正疾病造成的紊亂。1 多數(shù)非感染性疾病發(fā)生的根本原因是基因結(jié)構(gòu)的變異或表達(dá)水平的異常；感染性疾病則是病原體入侵在體內(nèi)表達(dá)外源性基因所致。授課老師：江黎明2022/7/291精選課件一、基因診斷的概念和特點(diǎn)二、基因診斷的主要技術(shù)方法三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)四、疾病的基因診斷(自習(xí))五、基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第一節(jié) 基因診斷 (gene diagnosis)2022/7/292精選課件 基因診斷通常是指利用分子生物學(xué)的方法技術(shù)，直接檢測(cè)體內(nèi)

2、DNA的結(jié)構(gòu)變異或RNA的水平變化，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。一 、基因診斷的概念和特點(diǎn)（一）概念 適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等法病學(xué)領(lǐng)域。2022/7/293精選課件（二）特點(diǎn)-以已知基因作為檢測(cè)對(duì)象（l）特異性強(qiáng)：直接檢測(cè)導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng) 等技術(shù)都具有信號(hào)放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時(shí)相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無(wú)臨床表現(xiàn)時(shí)作出診斷；（5）應(yīng)用廣泛：可檢測(cè)自體基因和外源基因。一 、基因診斷的概念和特點(diǎn)2022/7/294精選課件(一)核酸分子雜交（NA hybridiz

3、ation） (二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP） (四)DNA分子多態(tài)性（DNA polymorphism）分析(五)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術(shù)5(七)DNA序列測(cè)定（DNA sequencing） 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/295精選課件(一)核酸分子雜交4.DNA 芯片(DNA chip)技術(shù) Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡 (第七/六章)和Western/蛋白質(zhì)印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點(diǎn)印跡(dot blotting)與狹縫雜交2. 組

4、織原位雜交(tissure in situ hybridization )3. 等位基因特異性寡核苷酸雜交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH) 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/296精選課件71.斑點(diǎn)印跡(dot blotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點(diǎn)在NC膜上，變性后與標(biāo)記探針結(jié)合，顯影或顯色，密度測(cè)量，與對(duì)照品比較確定所測(cè)核酸量的高低。方法：應(yīng)用：主要用于檢測(cè)細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測(cè)和篩選；容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。特點(diǎn)：2022/7/297精選課件Slot-blot結(jié)果G

5、S-670型光密度掃描儀(Bio-Rad) 精選課件92.組織原位雜交(tissure in situ hybridization )組織或細(xì)胞 (新鮮組織切片、細(xì)胞涂片或石蠟切片)樣品做適當(dāng)處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標(biāo)記探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸雜交。方法：應(yīng)用：被檢測(cè)基因或mRNA在細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)及定位。特點(diǎn)：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細(xì)胞內(nèi)定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH) 用于特定基因的定位及其缺失、擴(kuò)增或重排的檢測(cè)。2022/7/299精選課件2022/7/2910精選課件原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴(kuò)增熒光原位雜交檢測(cè)2022/7/291

6、1精選課件熒光原位雜交2022/7/2912精選課件3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)和制備與野生型或突變型基因序列片段互補(bǔ)的兩種探針，分別與被檢DNA進(jìn)行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)變異所致疾病的診斷。特點(diǎn)：雜交條件要求嚴(yán)格，以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。2022/7/2913精選課件N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖2022/7/2914精選課件4. DNA 芯片(DNA chip)技術(shù)DNA點(diǎn)陣 (DNA array)把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時(shí)對(duì)

7、樣品中的多種核酸進(jìn)行檢測(cè)和分析。方法：應(yīng)用：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)、基因表達(dá)譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測(cè)。DNA微陣列 (DNA microarray)通過(guò)計(jì)算機(jī)控制點(diǎn)樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術(shù)。2022/7/2915精選課件(二)PCR 技術(shù) (第七/七章)1. PCR技術(shù)的原理 以DNA分子為模板，加入與擬擴(kuò)增DNA片段兩端分別互補(bǔ)的一對(duì)寡核苷酸鏈作為引物，在 DNA聚合酶的催化下，按照半保留復(fù)制的形式分別合成兩股新的DNA互補(bǔ)鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。 多次重復(fù)這一過(guò)程，可使這段 DNA拷貝數(shù)隨復(fù)制次數(shù)以指數(shù)形式擴(kuò)增。 二、基因診斷的主要技

8、術(shù)方法2022/7/2916精選課件2. 基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(shù) (1) DNA的微量分析 總RNA(或mRNA) ss-cDNA ds-cDNA PCR擴(kuò)增 PCR法靈敏度高，對(duì)模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2) RT-PCR(reverse transcriptional-PCR)2022/7/2917精選課件18(3)巢式-PCR(nested PCR) 用2對(duì)引物(外引物、內(nèi)引物)擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增的特異性(4) 不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR ) 2個(gè)引物濃度不等，一般采用50:1或100:1 的摩爾比，主要獲取單鏈DNA

9、作構(gòu)象分析或用作探針。2022/7/2918精選課件19(5)多重PCR(multiplex PCR) 在同反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增同一 DNA樣品中的多個(gè)不同序列區(qū)域，且每對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度都不同，可根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長(zhǎng)度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR) 針對(duì)等位基因的序列差異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，使引物的 3端與等位基因序列的差異堿基對(duì)應(yīng)，僅能與突變型或野生型互補(bǔ)。2022/7/2919精選課件(7)原位PCR (in situ PCR,IS-PCR) 技術(shù) 1)細(xì)胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細(xì)胞獲得適度的通透性，既利于 PCR反應(yīng)試劑

10、到達(dá)靶位，又可防止擴(kuò)增產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)漏出； 2)把載玻片的靶DNA進(jìn)行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴(kuò)增用RT-PCR); 3)最后通過(guò)間接法(原位雜交)或直接法(PRC過(guò)程中加入標(biāo)記)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。2022/7/2920精選課件（8）實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5- 3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)； 每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2022/7/2921精選課件22(三) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 利用單個(gè)或多個(gè)堿基不同、但序列長(zhǎng)度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具

11、有不同的構(gòu)象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(single strand comformation polymorphism, SSCP) 與正常的電泳圖型對(duì)照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/2922精選課件與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(cè)(初篩)。2022/7/2923精選課件241.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的檢測(cè)3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性的檢測(cè)(四)DNA分子多態(tài)性 (DNA polymorphism )分析(single nucleotide polymorphism, SNP )(var

12、iable number of tandem repeats, VNTR)(restriction fragment length polymorphism, RFLP ) 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/2924精選課件25VNTR的重復(fù)序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatellite DNA):重復(fù)單元長(zhǎng)度為670bp；微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA ):重復(fù)單元長(zhǎng)度為16bp。短串聯(lián)重復(fù)DNA(short tandem repeat DNA,STR DNA):重復(fù)單元長(zhǎng)度為26bp。根據(jù)重復(fù)單元長(zhǎng)度可分為：2022/7/2925精選課件

13、26 不同個(gè)體間重復(fù)單元 如(CA)n/(TG)n的拷貝數(shù) (即出現(xiàn)的頻率) 不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識(shí)別位點(diǎn) 限制酶識(shí)別位點(diǎn) 2022/7/2926精選課件27(五) 限制酶譜分析 當(dāng)某種限制酶的切點(diǎn)改變時(shí)(由點(diǎn)突變、單個(gè)堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過(guò)電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在 PCR擴(kuò)增后用該限制酶切割 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/2927精

14、選課件ABCDEFGDEFBGCA-GAATTC-CTTAAG-EFBG C +DAEcoR 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化2022/7/2928精選課件29(六)顯微切割(microdissection)技術(shù) 是應(yīng)用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個(gè)甚至一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析；可用于石蠟包埋組織進(jìn)行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細(xì)胞的顯微切割 是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點(diǎn)的染色體片段，再進(jìn)行后續(xù)分析。 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/2929精選課件 瑞士 MII CellCut 全自動(dòng)激光顯微切割（熒光）系統(tǒng) 可通過(guò)紫外激光切割需要分離的組織，然后通過(guò)

15、有黏性的Eppendorff管蓋進(jìn)行收集，這樣就可以將特定類型的細(xì)胞從組織切片上分離下來(lái)。2022/7/2930精選課件 可以準(zhǔn)確、快速、無(wú)損傷地分離出純凈的特定細(xì)胞或組織，保持細(xì)胞內(nèi)生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。 配有近紅外激光(波長(zhǎng)810nm)；紫外激光(波長(zhǎng)349nm)；紅色、綠色、藍(lán)色三種熒光濾光片。美國(guó)Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀2022/7/2931精選課件PICSAltraII流式細(xì)胞儀(分析分選)2022/7/2932精選課件33(七)DNA序列測(cè)定 該法是基因診斷所有的技術(shù)方法中最準(zhǔn)確最可靠的種。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)用高

16、。 二、基因診斷的主要技術(shù)方法2022/7/2933精選課件34(一)點(diǎn)突變的檢測(cè)三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(cè)(三)基因重排的檢測(cè)(四)基因擴(kuò)增的檢測(cè)(五)DNA多態(tài)性的檢測(cè) (六)基因表達(dá)異常的檢測(cè)(七)病原體基因的檢測(cè) 2022/7/2934精選課件35(一)點(diǎn)突變的檢測(cè) 狹義的點(diǎn)突變指堿基替代，分為單點(diǎn)突變和多點(diǎn)突變；廣義的點(diǎn)突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。 1.已知點(diǎn)突變的檢測(cè) 突變位點(diǎn)已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測(cè)。三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)2022/7/2935精選課件PCR/AS0H 檢測(cè): (1

17、)根據(jù)突變點(diǎn)上下游的序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR 擴(kuò)增出突變區(qū)的DNA片段。 (2) 將PCR產(chǎn)物用斑點(diǎn)或狹縫點(diǎn)樣器點(diǎn)在尼龍膜上，以紫外線照射固定。 (3) 針對(duì)上述每種突變位點(diǎn)，分別合成 2個(gè)寡核苷酸探針；其中一個(gè)具有正常的堿基序列，另一個(gè)則具有突變的堿基序列。 (4)分別預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色。 (5) 分析正常探針及突變探針?lè)謩e雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷2022/7/2936精選課件N：正常基因；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H 檢測(cè)示意圖)2022/7/2937精選課件2.未知點(diǎn)突變的檢測(cè)初篩：PCR-SSCP分析法確認(rèn)：D

18、NA sequencing。2022/7/2938精選課件PCR-SSCP: 廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(cè)(初篩)。2022/7/2939精選課件3. 少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測(cè) 可供選擇的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA測(cè)序等2022/7/2940精選課件鐮形細(xì)胞貧血原因：-珠蛋白鏈第 6位密碼子GAGGTG，造 成GluVal所致。方法：設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCR擴(kuò)增可得294bp，Oxa NI 消化，電泳。294191103bpA A：正常人BB：純合子病人CC：雜合子病人結(jié)果：2022/7/2941精選課件(二) 大片段核苷酸丟失或插入的檢測(cè) 1. 中等長(zhǎng)度

19、 (0.5-1.5kb) 的DNA片段缺失或插入，可用一對(duì)引物的普通PCR檢測(cè)。 2. 若基因較大度 (大于1.5kb) ，且多個(gè)位點(diǎn) 存在插入或缺失、位點(diǎn)間距離較遠(yuǎn)，宜采用多重PCR法檢測(cè)。5 33 5（多重PCR的引物設(shè)計(jì)示意圖）三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)2022/7/2942精選課件 DMD基因定位于人類 X染色體短臂 Xp21.2上。位于該區(qū)的dystrophin(肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白)基因的突變或部分缺失，是導(dǎo)致DMD的原發(fā)病因。 dystrophin基因中有9個(gè)易發(fā)生缺失的熱點(diǎn)區(qū)片段,它們分別位于外顯子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne

20、muscular dystrophy, DMD)2022/7/2943精選課件多重PCR法檢測(cè)中的基因突變 同時(shí)用2對(duì)引物雙重?cái)U(kuò)增dystrophin基因外顯子17和48區(qū)域內(nèi)的2個(gè)片段，可檢測(cè)出75左右的基因缺失型患者； 若同時(shí)用9對(duì)引物多重?cái)U(kuò)增，則可以檢測(cè)到90左右的基因缺失型患者。2022/7/2944精選課件(三) 基因重排的檢測(cè) 基因從一條染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其他染色體的某個(gè)位置稱基因易位或重排。1.熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 。 2.PCR擴(kuò)增 可用不同顏色的熒光標(biāo)記DNA探針，可在染色體上定位基因或DNA片段及它們彼此間的排序。 前提條件是已知重排基因和位點(diǎn)的序列。三、常見(jiàn)的

21、基因異常及其檢測(cè)2022/7/2945精選課件熒光原位雜交（雙色FISH）2022/7/2946精選課件(四) 基因擴(kuò)增的檢測(cè) 基因擴(kuò)增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象,可增加幾十到上千倍。 可用待測(cè)基因的 DNA片段或cDNA片段為探針，基因組DNA 采用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖泻笞鱏outhern印跡雜交分析。三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)2022/7/2947精選課件 (五)DNA多態(tài)性的檢測(cè) 1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)2.數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多性 多態(tài)性位點(diǎn)周圍DNA序列已知時(shí)，可用PCR/ RFLP分析。 針對(duì)串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增后電泳。三、常見(jiàn)的基因異

22、常及其檢測(cè)2022/7/2948精選課件1 .mRNA 的相對(duì)定量分析 (1) 斑點(diǎn)雜交或狹線雜交 放射或非放射標(biāo)記的cDNA探針與待測(cè)RNA雜交，經(jīng)顯影或顯色，與正常對(duì)照比較即可定量待測(cè)RNA。 (2) RT-PCR 法 對(duì)電泳凝膠中的擴(kuò)增產(chǎn)物cDNA行光密度掃描，計(jì)算模板mRNA的量；若dNTPs 帶放射性標(biāo)記，作放射活性測(cè)定，并由此推算mRNA的含量。(六)基因表達(dá)異常的檢測(cè)三、常見(jiàn)的基因異常及其檢測(cè)2022/7/2949精選課件2.mRNA的絕對(duì)定量分析 (1)采用一系列已知不同濃度的與待測(cè)mRNA序列相同但長(zhǎng)度不同的內(nèi)對(duì)照mRNA，在同一體系中一同進(jìn)行RT-PCR(加32p-dCTP

23、)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，分別測(cè)定兩者放射性強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出特異mRNA的量。 (2)用熒光定量PCR法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物定量。3.mRNA的長(zhǎng)度分析 (2)先分析RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶長(zhǎng)度，后測(cè)序確認(rèn)。 (1)采用Northern印跡雜交法檢測(cè)某種特異的mRNA的長(zhǎng)度有否改變； 2022/7/2950精選課件(一)遺傳病的基因診斷1.血紅蛋白?。╤emoglobinopathy） 四、疾病的基因診斷(自習(xí))2.苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)(二) 感染性疾病的基因診斷1.乙型肝炎的基因診斷2.痢疾桿菌和侵襲性大腸桿菌的檢測(cè)(三) 腫瘤的基因診斷1.肺癌(lung cance