食品中微生物毒素的測定技術(shù)課件

1、食品中微生物毒素的測定技術(shù)第一節(jié) 食品中黃曲霉毒素的測定方法第二節(jié) 食品中雜色曲霉毒素的測定方法第三節(jié) 食品中赭黃曲霉毒素的測定方法第四節(jié) 食品中葡萄球菌腸毒素的測定方法食品中微生物毒素的測定技術(shù)第一節(jié) 食品中黃曲霉毒素的測定方法 一、概述 黃曲霉毒素（Aflatoxin,簡稱AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。 1化學(xué)結(jié)構(gòu) 它是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其基本結(jié)構(gòu)均含有一個(gè)雙氫呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?。目前已知的黃曲霉毒素約有26種，除了有黃曲霉毒素 Bl、B2、Gl、G2、ML、M2、B2a、G2a、BM2a、GM2a外，尚有多種黃曲霉毒素的代謝產(chǎn)物、異構(gòu)體和相似物，如L、L-

2、H1、2，3-二羥基Bl、Bl-2，3環(huán)氧化物、四氫脫氧- Bl、1-甲氧基B2、2-甲氧基B2、1-乙氧基G2、1-乙氧基B2、1-乙酰氧基B2、GM1、Q1、Q2a、Q1-HS、B3、P1等。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 黃曲霉毒素是一類在紫外線照射下能發(fā)出強(qiáng)烈特殊熒光的物質(zhì)，根據(jù)其在波長為365nm紫外光下呈現(xiàn)不同顏色的熒光而分為B、G兩大族，其中B族毒素發(fā)出藍(lán)色熒光，而G族毒素發(fā)出綠色熒光。B族中有AFTBl、B2、ML、M2、B2a、BM2a、L、L-H1、2，3-二羥基Bl、Bl-2，3環(huán)氧化物、四氫脫氧- Bl、1-甲氧基B2、2-甲氧基B2、1-乙氧基B2、1-乙酰氧基B2、Q1

3、、Q2a、Q1-HS、B3、P1；G族中有AFTGl、G2、G2a、GM2a、1-乙氧基G2、GM1等。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 2理化性質(zhì) 黃曲霉毒素的相對分子質(zhì)量為312346，熔點(diǎn)為200300。難溶于水，不溶于己烷、乙醚和石油醚，易溶于油、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二甲基甲酰等有機(jī)溶劑。一般在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH910的強(qiáng)酸溶液中分解迅速，生成幾乎無毒的鹽，但反應(yīng)是可逆的。其純品為無色結(jié)晶，耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度高達(dá)280，紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 3主要產(chǎn)毒菌株 黃曲霉、寄生曲霉及溫特曲霉（產(chǎn)量較

4、少），它們污染食物后生長繁殖產(chǎn)生的毒素。 4.分布 黃曲霉、寄生曲霉等霉菌在自然界普遍存在，很容易污染食品，尤其是花生、玉米和核桃。在大豆、稻谷、小麥、通心粉、皮蛋、調(diào)味品、牛奶、奶制品、食用油、干咸魚及辣椒等食品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。其污染程度受地區(qū)和季節(jié)因素以及作物生長、收獲、貯存的不同條件影響。表5-1中列出了世界各地各種食品中黃曲霉毒素存在的情況。 食品中微生物毒素的測定技術(shù)食品中微生物毒素的測定技術(shù) 黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株的生長繁殖最適宜的條件是：溫度3038、相對濕度80%以上。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)溫度為2832、相對濕度在80%以上時(shí)產(chǎn)生AFT量最高。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)AFT的檢出率比

5、較高。在中國，華中、華南地區(qū)產(chǎn)毒菌株相對較多，產(chǎn)毒量也大，東北、西北地區(qū)相對較少。 5.毒性 黃曲霉毒素能引起人及動物肝臟組織受破壞，嚴(yán)重時(shí)，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 在各種黃曲霉毒素中，以AFTB1的毒性和致癌性最強(qiáng)。比其他化學(xué)致癌劑氰化鉀還高，比二甲基偶氮苯大900倍，比二甲基硝胺大75倍，相對而言,AFTG1和M1的致癌性較弱。 在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，故食品中污染的黃曲霉毒素含量常以AFTB1為主要指標(biāo)。 6.限量 199

6、5年，世界衛(wèi)生組織制定的食品中黃曲霉毒素最高允許濃度為15g/kg。 中國政府對食品中黃曲霉毒素的含量有嚴(yán)格規(guī)定，國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761規(guī)定了黃曲霉毒素在食品中的允許最大濃度，見表5-2。食品中微生物毒素的測定技術(shù)食品中微生物毒素的測定技術(shù) 美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒素含量（指B1+ B2+G1+G2的總量）不能超過15g/kg，人類消費(fèi)的牛奶中的含量不能超過05g/kg，其他動物飼料中的含量不能超過300g/kg。而歐盟國家規(guī)定更加嚴(yán)格，要求人類生活消費(fèi)品中的黃曲霉毒素B1的含量不能超過2g/kg，總量不能超過4g/kg，牛奶和奶制品中的黃曲霉毒素M1含量不能超

7、過005g/kg，世界各國及地區(qū)對花生及其制品中黃曲霉毒素的最高允許含量見表5-3。食品中微生物毒素的測定技術(shù)食品中微生物毒素的測定技術(shù) 本節(jié)主要介紹食品中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2總量、黃曲霉毒素M1與B1的測定方法。 二、食品中黃曲霉毒素B1的測定 （一）薄層色譜法 （TLC） 薄層色譜法是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.222003黃曲霉毒素B1的測定方法中的第一法，此法適用于糧食、花生及其制品、薯類、豆類、發(fā)酵食品及酒類等各種食品中AFTB1的測定方法，在此法中，薄層板上AFTB1的最低檢出量是0.0004g，檢出限為5g/kg。食品中微生物毒素的測定技術(shù)

8、 1原理 試樣中黃曲霉毒素B1經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凈化、濃縮，并經(jīng)薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量來測定AFTB1的含量。 2試劑 （1）試劑 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程3060或6090）、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚（經(jīng)無水硫酸鈉脫水）、丙酮、三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、硅膠G（薄層色譜用）。 苯-乙腈（98+2）混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混勻。 甲醇-水（55+45）溶液：量取55mL甲醇，加45mL蒸餾水，混勻。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （2）AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)貯備液 用百萬分之一的微量分析天平精

9、密稱取11.2mgAFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100 mL，避光置于4冰箱中保存。先用紫外分光光度計(jì)測定配制的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)貯備液濃度，再用苯-乙腈混合液調(diào)整其濃度為10g/mL。在350nm，AFTB1在苯-乙腈（98:2）混合液中的摩爾消光系數(shù)為19 800。 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液（1g/mL） 精密吸取1.0 mL 10g/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此液含AFTB1為1g/mL。 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.2g/mL） 精密吸取1.0 mL 1g/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，搖勻

10、。此液含AFTB1為0.2g/mL。 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04g/mL） 精密吸取1.0 mL 0.2g/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，搖勻。此液含AFTB1為0.04g/mL。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （3）消毒液 50g/L次氯酸鈉溶液 稱取100g漂白粉精，加入500mL水，攪拌均勻。另將160g工業(yè)用碳酸鈉（Na2CO310H2O）溶于500mL溫水中。再將兩液混合、攪勻，澄清后過濾，貯存于帶橡皮塞的玻璃瓶中，作為AFTB1消毒劑。 3主要儀器 小型粉碎機(jī)、分樣篩、電動振蕩器、全玻璃濃縮器或250mL索氏抽提器、玻璃板（5cm20cm）、薄層

11、板涂布器、展開槽（內(nèi)長25cm、寬6cm、高4cm）、紫外光燈（lOO125W，帶有波長365nm濾光片）、微量注射器或血色素吸管等。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 4操作步驟 （1）取樣 試樣中污染黃曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右測定結(jié)果，而且有毒霉粒的比例小，同時(shí)分布不均勻。為避免取樣帶來的誤差，應(yīng)大量取樣，并將該大量試樣粉碎，混合均勻，才有可能得到確能代表一批試樣的相對可靠的結(jié)果，因此采樣應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 根據(jù)規(guī)定采取有代表性試樣。 對局部發(fā)霉變質(zhì)的試樣檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)單獨(dú)取樣。 每份分析測定用的試樣應(yīng)從大樣經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.51kg，然后全部粉碎。糧食試樣全部通過20目篩，混勻。花

12、生試樣全部通過10目篩，混勻?；?qū)⒑谩姆謩e測定，再計(jì)算其含量?；ㄉ秃突ㄉu等試樣不需制備，但取樣時(shí)應(yīng)攪拌均勻。必要時(shí)，每批試樣可采取3份大樣作試樣制備及分析測定用，以觀察所采試樣是否具有一定的代表性。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （2）樣品預(yù)處理（提取、凈化與濃縮） 玉米、大米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等 甲法： 稱取20.OOg粉碎過篩試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和lOOmL甲醇-水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴(yán)防漏。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇-水溶

13、液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。取20.OOmL甲醇-水溶液（相當(dāng)于4g試樣）置于另一個(gè)125mL分液漏斗中。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 在第二個(gè)分液漏斗中加20mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層，（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層）。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷于重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜于65水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻23min后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液（或?qū)⑷燃淄橛脻饪s蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入lmL苯

14、-乙腈混合液）。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌希粲斜降慕Y(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 乙法： （限于玉米、大米、小麥及其制品）。稱取20.OOg粉碎過篩試樣于250mL具塞錐形瓶中，用滴管滴加約6mL水，使試樣濕潤，準(zhǔn)確加入60mL三氯甲烷，振蕩30min，加12g無水硫酸鈉，振搖后，靜置30min，用疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于lOOmL具塞錐形瓶中。取12mL濾液（相當(dāng)4g試樣）于蒸發(fā)皿中，在65水浴上通風(fēng)揮干，準(zhǔn)確加入lmL苯-乙腈混合液，用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌希?/p>

15、有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 花生油、香油、菜油等 稱取4.00g混勻的試樣置于小燒杯中，用20mL正己烷或石油醚將試樣轉(zhuǎn)移于125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分次洗燒杯，洗液一并移人分液漏斗中，振搖2min，靜置分層后，將下層甲醇-水溶液移入第二個(gè)分液漏斗中，再用5mL甲醇-水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并移人第二個(gè)分液漏斗中。在第二個(gè)分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，（以下按“甲法”自“振搖2min，靜置分層”起依法操作）。 醬油、醋、發(fā)酵酒類 稱取10.OOg試樣于小燒杯

16、中，為防止提取時(shí)乳化，加0.4g氯化鈉（發(fā)酵酒類不加），移人分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗滌燒杯，洗液并人分液漏斗中。（以下按“甲法”自“振搖2min，靜置分層”起依法操作）。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相當(dāng)于4g試樣。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 或稱取10.OOg試樣，置于分液漏斗中，再加12mL甲醇（以醬油體積代替水，故甲醇與水的體積比仍約為55+45），用20mL三氯甲烷提取，（以下按“甲法”自“振搖2min，靜置分層”起依法操作）。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4g試樣。 干醬類（包括豆豉、腐乳制品） 稱取20.OOg研磨均勻的試樣，置于2

17、50mL具塞錐形瓶中，加入20mL正己烷或石油醚與50mL甲醇-水溶液。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式快速定性濾紙過濾，濾液靜置分層后，取24mL甲醇-水層（相當(dāng)8g試樣，其中包括8g干醬類本身約含有4mL水的體積在內(nèi)）置于分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，（以下按“甲法”自“振搖2min，靜置分層”起依法操作）。最后加人2mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4g試樣。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （3）測定 A單向展開法 薄層板的制備 稱取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量23倍左右的水，用力研磨l2min,至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5cm20cm，厚度約0.25mm的薄層板三塊。在

18、空氣中干燥約15min后，在100下活化2h，取出放干燥器中保存。一般可保存23天，若放置時(shí)間較長，可再活化后使用。 點(diǎn)樣 將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為lcm，點(diǎn)直徑約3mm。在同一塊板上滴加樣點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)邊點(diǎn)邊吹。滴加的4個(gè)樣點(diǎn)如下： 第一點(diǎn)：lOL 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液。 第三點(diǎn)：20L樣液+lOL0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液+lOL0.02g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。食品中微生物毒素的

19、測定技術(shù) 展開與觀察 在展開槽內(nèi)加l0mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加l0mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開l012cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下: 第一點(diǎn)滴加了l0L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中含黃曲霉毒素B1是0.0004g，是AFTB1的最低檢出量點(diǎn)。同時(shí)，此點(diǎn)還可以檢驗(yàn)薄層板好壞和色譜條件是否合適，若展開后此點(diǎn)無熒光，則可能是薄層板未制好，或色譜條件有問題。 第三點(diǎn)和第四點(diǎn)的樣液點(diǎn)滴加了AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，可使樣點(diǎn)中AFTB1熒光點(diǎn)與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液熒光點(diǎn)重疊。如樣液點(diǎn)為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中AFTB1為0.0004g，可用

20、作檢查在樣液內(nèi)AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中AFTB1為0.002g，主要起定位作用。在上述色譜條件下，AFTB1的Rf0.6左右。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 第二點(diǎn)是樣點(diǎn)。在與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置（Rf0.6）上無藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，而其他點(diǎn)均有熒光點(diǎn)，表示試樣中AFTB1含量在5g/kg以下；如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。 確證試驗(yàn) 為了證實(shí)薄層板上樣液熒光確系由AFTB1產(chǎn)生的，滴加三氟乙酸，使其與AFTB1反應(yīng)，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值Rf0.1左右。方法是于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：lOL

21、 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液。 于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40，再于薄層板右邊滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。 食品中微生物毒素的測定技術(shù) 第三點(diǎn)：lOL 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液。 再展開（同），在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物（Rf0.1）。未加三氟乙酸的第三點(diǎn)和第四點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。 稀釋定量 樣液中（4g樣品/mL，點(diǎn)樣20L）的AFTB1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量（0.0004

22、g）的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中AFTB1含量即為5g/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少點(diǎn)樣量，或?qū)右合♂尯笤冱c(diǎn)樣，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。點(diǎn)樣形式如下： 第一點(diǎn)：lOL 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：根據(jù)情況點(diǎn)lOL樣液。 第三點(diǎn)：根據(jù)情況點(diǎn)l5L樣液。 第四點(diǎn)：根據(jù)情況點(diǎn)2OL樣液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 結(jié)果計(jì)算 試樣中黃曲霉毒素B1的含量按下式進(jìn)行計(jì)算： X=0.0004 （5-1） 式中： X 試樣中AFTB1的含量，g/kg； Vl 加入苯-乙腈混合液的體積，mL； V2 出現(xiàn)最低熒光強(qiáng)度時(shí)滴加樣液樣液的體

23、積，mL； D 樣液的總稀釋倍數(shù)； m 加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)試樣的質(zhì)量，g； 0.0004 AFTB1的最低檢出量，g； 結(jié)果表示到測定值的整數(shù)位。食品中微生物毒素的測定技術(shù) B雙向展開法 如用單向展開法展開后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了黃曲霉毒素B1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙醚作橫向展開，將于擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊而黃曲霉毒素B1不動，然后再用丙酮-三氯甲烷（8+92）作縱向展開，試樣在黃曲霉毒素B1相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法靈敏度。如用雙向展開中滴加兩點(diǎn)法展開仍有雜質(zhì)干擾時(shí)，則可改用滴加一點(diǎn)法。 滴加兩點(diǎn)法 點(diǎn)樣 取薄層板三塊，在距下端3cm基線

24、上滴加AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣0.8lcm處各滴加10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，在距左邊緣2.83cm處各滴加20L樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴10L 0.2g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 展開 橫向展開： 在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10mL無水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長邊置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時(shí)可再重復(fù)展開12次。 縱向展開： 揮干的薄層板，以丙酮-三氯甲烷（8+92）展開至1012cm為止。丙酮與

25、三氯甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 觀察及評定結(jié)果 在紫外光燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中AFTB1含量在5g/kg以下。 若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點(diǎn)與第一板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。 在具體測定中，第一、二、三板可以同時(shí)做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三板可以省略；如第一板為陽性，則第二板可以省略，直接作第三板。食品中微生物毒素的測定

26、技術(shù) 確證試驗(yàn) 另取薄層板兩塊，于第四、第五兩板距左邊緣0.81cm處各滴加10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.83cm處，于第四板滴加20L樣液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20L樣液和10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液AFTB1含量高時(shí)，則將樣液稀釋后，再做確證試驗(yàn)。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 稀釋定量 如樣液AFTB1含量高時(shí)

27、，將樣液稀釋后再點(diǎn)樣，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止;如AFTB1含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開法測定，以確定含量。 結(jié)果計(jì)算 同公式（5-1）。 滴加一點(diǎn)法： 點(diǎn)樣 取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板距左邊緣0.8lcm處各滴加20L樣液，在第二板的點(diǎn)上加滴10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，在第三板的點(diǎn)上加滴10L 0.2g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 展開 （同滴加兩點(diǎn)法）的橫向展開與縱向展開。 觀察及評定結(jié)果 在紫外光燈下觀察

28、第一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，試樣中AFTB1含量在5g/kg以下。如第一板在與第二板AFTB1相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點(diǎn)是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊再進(jìn)行以下確證試驗(yàn)。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 確證試驗(yàn) 另取兩板，于距左邊緣0.81cm處，第四板滴加20L樣液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20L樣液、10L 0.04g/mL AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1滴三氟乙酸。（產(chǎn)生衍生物及展開方法同滴加二點(diǎn)法）。再將以上二板在紫外光燈下觀察，以確定樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍

29、生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過以上確證試驗(yàn)定為陽性后，再進(jìn)行稀釋定量，如含AFTB1低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中AFTB1熒光的強(qiáng)弱，直接用雙向展開法定量。 結(jié)果計(jì)算 同公式（5-1）。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （二）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。在抗原與抗體反應(yīng)形成復(fù)合物后，該酶結(jié)合物的酶作用于加入的底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定性或定量抗體/抗原。 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是免

30、疫酶技術(shù)的一種。其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原/抗體，使之固相化。免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)在其中進(jìn)行。無論是免疫反應(yīng)，還是酶促反應(yīng)，每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了未反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次，即可用二抗（抗抗體）、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。 食品中微生物毒素的測定技術(shù) 此法簡便、敏感、特異，可作為多種抗原或抗體的定量測定，故而得到廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)70年代后期，該法被引入到真菌毒素的檢測中。 酶聯(lián)免疫吸附法是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.222003黃曲霉毒素B1的測定方

31、法中的第二法，此法適用于糧食、花生及其制品、薯類、豆類、發(fā)酵食品及酒類等各種食品中AFTB1的測定方法，在此法中，AFTB1的檢出限為0.01g/kg。 1原理 試樣中的黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較測定含量。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 2儀器 小型粉碎機(jī)、電動振蕩器、酶標(biāo)儀（內(nèi)置490nm濾光片）、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)微孔板、微量加樣器及配套吸頭等。 3試劑 （1）試劑 三氯甲烷、甲醇、石油醚、牛血清白蛋白（BSA）、鄰苯二胺（OPD）、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯

32、化鈉、氯化鉀、過氧化氫、硫酸、吐溫-20、抗黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體（或抗血清）、AFTBl與載體蛋白（牛血清白蛋白或多聚賴氨酸等）的結(jié)合物、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG等。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （2）ELISA緩沖液系統(tǒng) 包被緩沖液（pH96的碳酸鹽緩沖液）的制備 Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g、加蒸餾水至1000mL。 磷酸鹽緩沖液（pH7.4 PBS）的制備 KH2PO4 0.2g、Na2HPO412H2 2.9g、NaCI 8.0g、KCI 0.2g、加蒸餾水至1000mL。 洗液（PBS-T）的制備 PBS加0.05（V/V）吐溫-20；

33、 抗體稀釋液的制備 牛血清白蛋白（BSA）1.0g加PBS-T至1000mL。 底物緩沖液（pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液）的制備食品中微生物毒素的測定技術(shù) A液（0.1mol/L檸檬酸水溶液） 檸檬酸（C6H8O，H2O） 21.01g,加蒸餾水至1000mL。 B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液） Na2HP0412H20 716g,加蒸鎦水至1000mL。 用前按A液+B液+蒸餾水=24.3+25.7+50的比例（體積比）配制。 封閉液的制備 牛血清白蛋白（BSA）1.0g加PBS-T至1000mL。 終止液 2mol/L 硫酸。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （3）黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)

34、溶液 用甲醇將AFTB1配制成lmg/mL的溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀釋至約10g/mL，用紫外分光光度計(jì)測此溶液最大吸收峰的光密度值，帶入下式計(jì)算，計(jì)算該溶液中AFTB1的濃度。 X=式中：X該溶液中AFTB1的濃度，g/mL； A測得的光密度值； MAFTB1的分子量，312； E摩爾消光系數(shù)，21800； f 使用儀器的校正因素。 根據(jù)計(jì)算將該溶液配成10g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測時(shí)，用甲醇-PBS溶液將該標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至所需濃度。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 4測定步驟 （1）取樣 （同第一法） （2）提取 大米和小米（脂肪含量3.0）的提?。?試樣粉碎后過20目篩，稱取200

35、g，加入250mL具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加人60mL三氯甲烷，蓋塞后滴水封嚴(yán)。150r/min振蕩30min。靜置后，用快速定性濾紙過濾于50mL燒杯中。立即取12mL濾液（相當(dāng)4.0g試樣）于75mL蒸發(fā)皿中，65水浴通風(fēng)揮干。用2.0mL20甲醇-PBS分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結(jié)物，移至小試管，加蓋振蕩后靜置待測。此液每毫升相當(dāng)2.0g試樣。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 玉米的提?。ㄖ竞?.05.0） 試樣粉碎后過20目篩，稱取200g，加入250mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入500mL甲醇-水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴(yán)。1

36、50r/min振蕩30min。用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中。待分層后，放出下層甲醇-水溶液于50mL燒杯中，從中取10.0mL（相當(dāng)于40g試樣）于75mL蒸發(fā)皿中。（以下按自“65水浴通風(fēng)揮于”起依法操作。）食品中微生物毒素的測定技術(shù) 花生的提?。ㄖ竞?5.045.0） 試樣去殼去皮粉碎后稱取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100.0mL甲醇-水（55+45）溶液和30mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴(yán)。150r/min振蕩30min。靜置15min后用快速定性濾紙過于125mL分液漏斗中。待分層后，放出下層甲醇-水溶液于100mL燒杯中，從中取20.0mL（相當(dāng)于4

37、.0g試樣）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層（如有乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層），放出三氯甲烷于75mL蒸發(fā)皿中。再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重復(fù)振搖提取后，放出三氯甲烷一并于蒸發(fā)皿中，（以下按自“65水浴通風(fēng)揮于”起依法操作。）食品中微生物毒素的測定技術(shù) 植物油的提取 用小燒杯稱取4.0g試樣，用20.0mL石油醚，將試樣移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇-水（55+45）溶液分次洗燒杯，溶液一并移于分液漏斗中（精煉油4.0g樣為4.525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶劑后振搖），振搖2min。靜置分層后，放出下層甲醇-水溶

38、液于75mL蒸發(fā)皿中，再用5.0mL甲醇-水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并加入蒸發(fā)皿中，（以下按自“65水浴通風(fēng)揮于”起依法操作。）食品中微生物毒素的測定技術(shù) （3）ELISA測定 將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測樣品（含有抗原）提取液的混合液，競爭培養(yǎng)后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過酶標(biāo)檢測儀測出酶底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 包被微孔板 用A

39、FTBl-BSA人工抗原包被酶標(biāo)微孔板，150L/孔，4過夜。 抗體抗原反應(yīng) 將AFTBl純化單克隆抗體稀釋后，分別與等量不同濃度的AFTBl標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣提取液，分別用2mL試管混合振蕩后，4靜置。前者用于制作AFTBl標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線；后者用于測定試樣中AFTBl含量。 封閉 已包被的酶標(biāo)板用洗液洗3次，每次3min后，加封閉液封閉，250L/孔，置37下1h。 食品中微生物毒素的測定技術(shù) 測定 酶標(biāo)板洗33min后，加抗體抗原反應(yīng)液（在酶標(biāo)板的適當(dāng)孔位加抗體稀釋液或Sp2/0培養(yǎng)上清液作為陰性對照）130L/孔， 37，2h。 酶標(biāo)板洗33min，加酶標(biāo)二抗（1:200，v/v）100L/孔

40、，1h。 酶標(biāo)板用洗液洗53min。加底物溶液（10mgOPD），加25mL底物緩沖液，加37L 30H202，100L/孔，37，15min，然后加2mol/L H2SO4，40L/孔，以終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀490nm，測出被檢測物吸收掉的光密度（OD值）。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （4）結(jié)果計(jì)算 黃曲霉毒素Bl的濃度按下式進(jìn)行計(jì)算。 AFTBl濃度（ng/g）=式中： C酶標(biāo)微孔板上所測得的AFTBl含量，ng （納克），對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線按數(shù)值插入法求得； Vl樣品提取液的體積，mL； V2滴加樣液的體積，mL； D稀釋倍數(shù)； M2試樣質(zhì)量，g。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 由于按標(biāo)準(zhǔn)曲線直接

41、求得的AFTBl濃度（C1）的單位為納克每毫升（ng/g），而測孔中加入的試樣提取的體積為0.065mL，所以公式中 C=0.065mLCl 而Vl2mL，V=0.065mL，D2，m24g代人公式，則 黃曲霉毒素B1濃度（ng/g）0.065Cl = Cl（ng/g） 所以，在對試樣提取完全按本方法進(jìn)行時(shí)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線直接求得的數(shù)值Cl ，即為所測試樣中黃曲霉毒素Bl的濃度（ng/g）。 注意：ELISA法可檢測范圍在ng至pg水平，屬于超微量分析技術(shù)。它對試劑、蒸餾水、抗原抗體比例、微孔板以及實(shí)驗(yàn)各步驟的反應(yīng)條件和操作，都有嚴(yán)格要求。 食品中微生物毒素的測定技術(shù) 三、食品中黃曲霉毒素B1 B

42、2 G1 G2總量的測定 （一）薄層色譜法 1原理 試樣經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下，黃曲霉毒素B1 B2產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，黃曲霉毒素G1 G2產(chǎn)生黃綠色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示的熒光的最低檢出量來定量。 2試劑 （1）試劑 三氯甲烷、正己烷或石油醚（沸程3060或6090）、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚（經(jīng)無水硫酸鈉脫水）、丙酮。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、硫酸（1+3）、硅膠G（薄層色譜用）。 苯-乙腈（98+2）混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混勻。 甲醇-水（55+45）溶液：量取55mL甲醇，加45mL蒸餾水，混勻。 苯-乙

43、醇-水（46+35+19）展開劑：取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振搖5min，靜置過夜。將上下層溶液分別置于具塞瓶中保存，上下層交界的溶液棄去。若出現(xiàn)混濁，則在80水浴上加熱，待清晰后即停止加熱，取上層溶液作展開劑用。另取一定量下層溶液置小皿中，再放于展開槽內(nèi)。將薄層板放入展開槽內(nèi)，預(yù)先飽和10min后展開。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （2）黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2標(biāo)準(zhǔn)溶液 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液（10g/mL） 準(zhǔn)確稱取黃曲霉毒素B1 和 G1標(biāo)準(zhǔn)品各11.2mg，黃曲霉毒素B2 和 G2標(biāo)準(zhǔn)品各0.50.6mg，用苯-乙腈混合液作溶劑配制。 黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2的分子量及用苯

44、-乙腈混合液作溶劑時(shí)的最大吸收峰的波長及摩爾消光系數(shù)見表5-4。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 每毫升相當(dāng)于0.2g黃曲霉毒素B1 、 G1及0.1g黃曲霉毒素B2 、G2，作定位用。 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 每毫升相當(dāng)于0.04g黃曲霉毒素B1 、 G1及0.02g黃曲霉毒素B2 、G2，作最低檢出量用。 （3）消毒液 50g/L次氯酸鈉溶液 稱取100g漂白粉精，加入500mL水，攪拌均勻。另將160g工業(yè)用碳酸鈉（Na2CO310H2O）溶于500mL溫水中。再將兩液混合、攪勻，澄清后過濾，貯存于帶橡皮塞的玻璃瓶中，作為AFTB1消毒劑。食品中微生物毒素的測定技術(shù)

45、 3主要儀器 小型粉碎機(jī)、分樣篩、電動振蕩器、全玻璃濃縮器或250mL索氏抽提器、玻璃板（5cmX20cm）、薄層板涂布器、展開槽（內(nèi)長25cm、寬6cm、高4cm）、紫外光燈（lOO125W，帶有波長365nm濾光片）、微量注射器或血色素吸管等。 4操作步驟 （1）取樣、樣品預(yù)處理。（同AFTB1） （2）測定 A單向展開法 薄層板的制備 稱取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量23倍左右的水，用力研磨l2min,至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5cm20cm，厚度約0.25mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，在100下活化2h，取出放干燥器中保存。一般可保存23天，若放置時(shí)間較長，可再活

46、化后使用。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 點(diǎn)樣 將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為lcm，點(diǎn)直徑約3mm。在同一塊板上滴加樣點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)邊點(diǎn)邊吹。滴加的4個(gè)樣點(diǎn)如下： 第一點(diǎn)：lOL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液。 第三點(diǎn)：20L樣液+lOL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液+lOL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 展開與觀察 黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2的比移值依次排列為B1 B2 G1 G2。 在展開槽內(nèi)加lOmL無水乙

47、醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加lOmL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開lO12cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下: 由于樣液點(diǎn)上加滴黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液或，可使黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2分別與樣液的黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2依次為0.0004、0.0002、0.0004、0.0002g，可用作檢查在樣液內(nèi)黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2的最低檢出量是否正常出現(xiàn)。如為陽性，則起定位作用。薄層板上的第四點(diǎn)中黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2依次為0.002、0.001、0.002、0.0

48、01g，主要起定位作用。 若第二點(diǎn)在與黃曲霉毒素B1 B2的相應(yīng)位置上無藍(lán)紫色熒光點(diǎn)；或在與黃曲霉毒素G1 G2的相應(yīng)位置上無黃綠色熒光點(diǎn)，表示試樣中黃曲霉毒素B1、G1含量在5g/kg以下；B2、G2含量在2.5g/kg以下；如在相應(yīng)位置上有以上熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 確證試驗(yàn) 黃曲霉毒素與三氟乙酸反應(yīng)產(chǎn)生衍生物，只限于B1和G1 ；B2和G2與三氟乙酸不起反應(yīng)。展開后B1和G1的衍生物比移值B1 G1。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：lOL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液。 于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱

49、風(fēng)2min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40，再于薄層板右邊滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。 第三點(diǎn)：lOL黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液。 再展開（同），在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1和G1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的第三點(diǎn)和第四點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。 黃曲霉毒素B2和G2的確證試驗(yàn)：用苯-乙醇-水（46+35+19）展開，若標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液點(diǎn)出現(xiàn)重疊，即可確定。 在展開的薄層板上噴以硫酸（1+3），黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2都變?yōu)辄S色熒光。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 稀釋定量 樣液中黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2 熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如各與黃曲霉毒素

50、B1 B2 G1 G2標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量（B1 G1為0.0004g， B2 G2為0.0002g）的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中黃曲霉毒素B1 G1含量為5g/kg，B2 G2含量為0.0002g/kg。如樣液中任何一種黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則需逐一進(jìn)行定量，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。 B雙向展開法 滴加兩點(diǎn)法: 點(diǎn)樣 取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣08lcm處各滴加10L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在距左邊緣283cm處各滴加20L樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在第三

51、塊板的樣液點(diǎn)上加滴10L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 展開 橫向展開、縱向展開。 觀察及評定結(jié)果 在紫外光燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中黃曲霉毒素B1、G1含量在5g/kg以下；黃曲霉毒素B2、G2含量在2.5g/kg以下。 若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點(diǎn)與第一板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行所需的確證試驗(yàn)。食品中微生物毒素的測定技術(shù)

52、 （二）微柱篩選法 可以用來半定量測定各種食品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的總量。 1原理 樣品提取液中的黃曲霉毒素，通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管，雜質(zhì)被氧化鋁吸附，黃曲霉毒素被硅鎂型吸附劑層吸附后，在波長365nm紫外光燈下顯示藍(lán)紫色熒光環(huán)，其熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系。若硅鎂型吸附劑層未出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光，則樣品為陰性（方法靈敏度為510g/kg）。 由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，所以測得結(jié)果為黃曲霉毒素總含量。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 2試劑 （1）甲醇、甲醇-水溶液（55+45）、正己烷或石油醚（沸程3060或6090）、

53、三氯甲烷、丙酮、脫脂棉、20g/L硫酸鈉溶液等。 （2）層析用 中性氧化鋁（100200目）、酸性氧化鋁（100200目）、無水硫酸鈉（需加工過篩成80100目、4080目）、硅鎂型吸附劑（100200目）。 （3）展開劑 丙酮-三氯甲烷（1+9） （4）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液 用三氯甲烷配制每毫升分別相當(dāng)于0.0025g 與0.0050g黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 注意：作層析用的酸性與中性氧化鋁、硅鎂型吸附劑、無水硫酸鈉應(yīng)在110120活化2h，裝瓶蓋嚴(yán)于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?，可保?周左右。 3儀器 （1）紫外光燈 100125W（帶有波長365nm濾光片）。 （2）

54、玻璃微柱管 內(nèi)徑0.4cm，長12cm，為便于加液可在管上部接一段粗的管口。（3）微柱層析架 附有接受洗脫廢液的容器，要盡可能密閉。 （4）微量注射器 50mL。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 4測定方法 （1）提取 糧食、花生及其制品、腐乳、黃醬類 稱取粉碎過篩（20目）樣品20.00g，置于250mL具塞錐形瓶內(nèi)。加lOOmL甲醇-水溶液，30mL石油醚（腐乳、黃醬類加20mL），并在塞上涂一層水，蓋嚴(yán)防漏，振蕩30min。靜置片刻。過濾時(shí)，先用力搖勻后，立即將樣液大量地倒人放有折疊式的約85cm直徑的快速定性濾紙的漏斗中，濾入50mL具塞量筒或比色管中。收集50mL甲醇-水濾液，（注意勿將上

55、層石油醚帶進(jìn)濾液中），轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加50mL20g/L硫酸鈉溶液稀釋，然后加入lOmL三氯甲烷，輕搖23min，靜置分層，三氯甲烷層通過裝有5g無水硫酸鈉的小漏斗脫水（以少量脫脂棉球塞住漏斗頸口，并以少量三氯甲烷潤濕），并濾入10mL比色管中，再向分液漏斗中3mL三氯甲烷重提一次，脫水后濾入原比色管中，以少量三氯甲烷洗漏斗，并定容至10.0mL，混勻，密塞，待測。此樣液每毫升相當(dāng)于1.0g樣品。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 植物油 稱取10.00g混勻的油樣，置于20.0mL小燒杯中。用50mL石油醚分?jǐn)?shù)次將樣品洗入lOOmL分液漏斗中，再用50mL甲醇-水溶液，輕搖23min，待靜置分層后

56、，將下層甲醇-水溶液轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中，加50mL20g/L硫酸鈉溶液稀釋，然后加入lOmL三氯甲烷，（以下按自“輕搖23min，”起操作）。此樣液每毫升相當(dāng)于1.0g樣品。 發(fā)酵酒、醬油、醋等水溶性食品 稱取20.00g混勻的樣品于小燒杯中，以80mL 20g/L硫酸鈉溶液洗入分液漏斗中，加入lOmL三氯甲烷。此樣液每毫升相當(dāng)于2.0g樣品。食品中微生物毒素的測定技術(shù) （2）測定 微柱管的制備 以少量脫脂棉作底層，用粗鐵絲砸實(shí)，置于微柱架上，依次加入05cm 80100目無水硫酸鈉、05cm硅鎂型吸附劑、05cm80100目無水硫酸鈉、15cm中性氧化鋁、15cm酸性氧化鋁、3cm4080目

57、無水硫酸鈉，頂部以少量脫脂棉堵塞。 微柱層析 取1裝好的微柱管，加入三氯甲烷提取的樣液lmL； 另取2支微柱管，分別加入1mL每毫升相當(dāng)于00025g及00050g 的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)使用液，相當(dāng)于樣品的濃度依次為5g/kg，lOg/kg，作標(biāo)準(zhǔn)管； 再另取1支微柱管，加入lmL三氯甲烷作為標(biāo)準(zhǔn)空白管。 待加液流至頂層時(shí)，即加入lmL丙酮-三氯甲烷展開劑（1+9）展開，在加樣或展開時(shí)，柱管均要保持垂直，待展開劑流完后，即可觀察結(jié)果，最好在2h內(nèi)進(jìn)行觀察。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 結(jié)果觀察與評定 在365nm波長紫外光燈下，將層析后的樣品微柱管依次與0，0.0025g 和0.0050g 的黃曲霉

58、毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)柱管比較，若樣品柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層只出現(xiàn)微黃色熒光環(huán)或與管一致，則樣品中黃曲霉毒素含量為陰性（在5g /kg或10g/kg以下）；若出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光環(huán)，則表示樣品中黃曲霉毒素含量可能超過了5g/kg或10g/kg，并需進(jìn)一步進(jìn)行確證測定（可按薄層層析法確證），并測定食品中黃曲霉毒素B1 B2 G1 G2的總量。食品中微生物毒素的測定技術(shù) 四、黃曲霉毒素M1的測定技術(shù) （一）食品中黃曲霉毒素M1與B1的測定 該方法適用于牛乳及其制品、黃油及新鮮豬組織（肝、腎、血、瘦肉）等食品中黃曲霉毒素M1與B1的測定。 1原理 試樣經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，黃曲霉毒素M1與B1在波長為365nm紫

59、外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。 2儀器 小型粉碎機(jī)；分樣篩；電動振蕩器；全玻璃濃縮器或250mL索氏抽提器；玻璃板（5cm20cm）；薄層板涂布器；展開槽（內(nèi)長25cm、寬6cm、高4cm）；紫外光燈（lOO125W，帶有波長365nm濾光片）；微量注射器或血色素吸管等。 食品中微生物毒素的測定技術(shù) 3.試劑和材料 （1）試劑 三氯甲烷；正己烷或石油醚（沸程3060或6090）；甲醇；苯；乙腈；無水乙醚或乙醚（經(jīng)無水硫酸鈉脫水）；丙酮；三氟乙酸；無水硫酸鈉；氯化鈉及4氯化鈉溶液；硫酸；異丙醇；硅膠G（薄層色譜用）；玻璃砂（用酸處理后，洗凈、干燥，約相當(dāng)2

60、0目） （2）AFTM1標(biāo)準(zhǔn)溶液 AFTM1標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10g/mL） 用三氯甲烷配制成每毫升相當(dāng)于10g的AFTM1標(biāo)準(zhǔn)溶液。以三氯甲烷作空白試劑，AFTM1的紫外最大吸收峰的波長應(yīng)接近357nm，摩爾消光系數(shù)為19950，避光，置于4冰箱中保存。 AFTM1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04g/mL） 用三氯甲烷配制每毫升相當(dāng)于0.04g的AFTM1標(biāo)準(zhǔn)溶液。以三氯甲烷作空白試劑，AFTM1的紫外最大吸收峰的波長應(yīng)接近357nm，摩爾消光系數(shù)為19950，避光，置于4冰箱中保存。 （3）AFTM1與B1混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 用三氯甲烷配制成每毫升相當(dāng)于0.04g的AFTM1與B1。避光，置于4冰箱中保存。食品