高效液相色譜法的簡(jiǎn)介課件

1、高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 一. 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）是20世紀(jì)六十年代末在經(jīng)典液相色譜法（LC）的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜（GC）的理論和技術(shù)，采用高壓泵、高效固定相以及高靈敏度檢測(cè)器發(fā)展而成的分離分析方法。1.1 HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 柱效低 分析周期長(zhǎng) 無(wú)法在線(xiàn)檢測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定

2、相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動(dòng)相 柱效高 分析時(shí)間大大縮短 可以在線(xiàn)檢測(cè)主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1.2 HPLC與GC差別1分析對(duì)象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品， 高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測(cè) ,占有機(jī)物的20%. HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制,分子量大、難氣化、熱穩(wěn) 定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè).用途廣范， 占有機(jī)物的80%。2.流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善

3、分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用,流動(dòng)相種類(lèi)較多，選擇余地廣,流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用,選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 ,可以增大分離選擇性.3操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┫嗤杭婢叻蛛x和分析功能，均可以在線(xiàn)檢測(cè) 主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別二. 高效液相色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用 “三高” “一快” “一廣” 高壓高柱效n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）三.各類(lèi)高效液相色譜法液-固吸附色譜液-液分配色譜 離子交換色譜 離子色譜 排阻色譜親和色譜1.

4、 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類(lèi)，可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)： 剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相。 硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。 高效液相色譜固定相和流動(dòng)相（）固定相2. 固定相按孔隙深度分類(lèi)，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類(lèi)表面多孔型固定相：它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。特點(diǎn)：多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，

5、出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。全多孔型固定相：它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相。特點(diǎn)：顆粒很細(xì)（310m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，最大允許進(jìn)樣量比表面多空型固定相大，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析（二）流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：(1) 高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度 也要求高。 (2) 低粘度。使用

6、高粘度溶劑，會(huì)增高壓力，不利于分 離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。 粘度過(guò)于低的溶劑易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離. 一般溶劑沸點(diǎn)要高于55，以便降低其揮發(fā)度(3) 化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。也要避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失。(4) 溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。(5) 溶劑要與檢測(cè)器匹配。 對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。3.1 液-固吸附色譜法 固定相為固體吸附劑,流動(dòng)相為液體。固定相：固體吸附劑為

7、，如硅膠、氧化鋁等，較常 使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異，即物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)分離的。適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性3.2 液-液分配色譜固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相色譜），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相色譜）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失較多，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：（將各

8、種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的填料作固定相(如在硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相)，以疏水性溶劑或混合物作流動(dòng)相(如己烷)的液相色譜。在液相色譜發(fā)展的早期，類(lèi)似于氣相色譜把含羥基、氨基或氰基的極性固定相涂漬在硅膠上這樣容易被流動(dòng)相沖洗掉，現(xiàn)在幾乎都使用鍵合固定相了。反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有機(jī)溶劑做流動(dòng)相的液相色譜。如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相，以極性強(qiáng)的水、甲醇、乙腈作流動(dòng)相的高效液相色譜。時(shí)間，min固定相：C1固定相：

9、C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見(jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見(jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正相色譜中，極性弱的物質(zhì)先被洗出。反相色譜中，極性強(qiáng)的物質(zhì)先被洗出。 3.3 離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)

10、脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽(yáng)離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等固定相按固定相制作方法可分為：1多孔型離子交換樹(shù)脂(包括微孔型和大孔型)；2表面多孔型(包括薄膜型)離子交換樹(shù)脂；3離子交換鍵合型。流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類(lèi)緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度) ，通過(guò)改變pH、緩沖劑類(lèi)型、

11、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。3.3 離子對(duì)色譜 分離原理： 離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱(chēng)對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法； 離子對(duì)色譜機(jī)理：離子對(duì)形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理；例如離子對(duì)形成機(jī)理：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，組分離子A-，加入一種反荷離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的組分離子生成離子對(duì)化合物A-B+。由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離

12、子的性質(zhì)不同，與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離子對(duì)疏水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同； 離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。3.4 排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。固定相3.5 親和色譜原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離先在載體表面鍵合上一種

13、具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。 上述每種色譜類(lèi)型均可進(jìn)一步分為多個(gè)不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用互相補(bǔ)充。 高效液相色譜法分類(lèi)和正反相色譜體系四.分離類(lèi)型的選擇1據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇 相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類(lèi)型（液固、液液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是2002000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。 2根據(jù)溶解度選擇 清楚樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果

14、樣品可溶于水屬則屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類(lèi)（如苯或異辛烷），則可采用液固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。3根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇 用紅外光譜法，可預(yù)先簡(jiǎn)單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液液分配色譜、液固吸附色譜；異構(gòu)體用液固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液液分配色譜高效液相色譜分離方法的選擇參考表 五.高效液相色譜儀 高效液相色譜儀HPLC示意圖色譜儀器的

15、流程由液體流動(dòng)相的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)放大記錄系統(tǒng)組成，其中高壓泵、色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。 1貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2高壓泵（輸液泵）3進(jìn)樣裝置4色譜柱分離5檢測(cè)器分析6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置 目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵，恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定，而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復(fù)泵、累積型往復(fù)泵、注射泵，恒壓泵有氣動(dòng)放大泵。各種高壓泵均具有以下性能：(1) 泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。(2) 能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓4050MPacm-2，能在824h連續(xù)

16、上作，壓力平穩(wěn)。(3) 輸出流量范圍寬。一般在0.0110mL/min。(4) 輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測(cè)器，大多數(shù)對(duì)流量變化敏感，高壓輸液泵應(yīng)提供無(wú)脈沖流量。這樣可以降低基線(xiàn)噪聲并獲較好的檢測(cè)下限，流量控制的精密度應(yīng)小于1，最好為0.5，重復(fù)性最好為0.5。 5.1高壓泵系統(tǒng)往復(fù)泵1.電機(jī)，2.往復(fù)凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液?jiǎn)蜗蜷y，5.溶劑入口，6.脈動(dòng)阻尼器,7.接色譜柱。5.2 梯度洗脫裝置外梯度: 將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室，用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。

17、5.3 進(jìn)樣系統(tǒng):微量注射器，高壓定量進(jìn)樣閥，自動(dòng)進(jìn)樣器（一）六通進(jìn)樣閥 如圖22-5所示。在狀態(tài)a位置，用微量注射器將樣品注入貯樣管。進(jìn)樣后，轉(zhuǎn)動(dòng)六通閥手柄至狀態(tài)b，貯樣管內(nèi)的樣品被流動(dòng)相帶入色譜柱。貯樣管的體積可按需固定。六通進(jìn)樣閥具有進(jìn)樣量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可帶壓進(jìn)樣等優(yōu)點(diǎn)（二）自動(dòng)進(jìn)樣裝置 采用微處理機(jī)控制進(jìn)樣閥采樣（通過(guò)閥針）、進(jìn)樣和清洗等操作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上（有轉(zhuǎn)盤(pán)式、排式），然后輸入程序（如進(jìn)樣次數(shù)、分析周期等），啟動(dòng)，設(shè)備將自行運(yùn)轉(zhuǎn)。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金

18、屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離的性能不受影響。5.4 高效液相色譜柱1.色譜柱類(lèi)型 按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類(lèi)型。 高效液相色譜柱2.保護(hù)柱 一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長(zhǎng)

19、使用壽命。3.柱恒溫器 對(duì)色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。 在液相色譜中，有兩種基本類(lèi)型的檢測(cè)器。一類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類(lèi)是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。 5.5 液相色譜檢測(cè)器 l. 光吸收檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器，光二極 管陣列檢測(cè)器，紅外吸收檢測(cè)器2. 熒光檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高3. 示差折光率檢測(cè)器：利用折光率的差別 靈敏度低，溫度要求嚴(yán)格4. 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器5. 電化學(xué)檢測(cè)器 液相色譜檢測(cè)器1. 紫外