液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用

1、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用摘要：本文綜述了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r，及其組成、特點(diǎn)、和儀器分類，并 且總結(jié)了它在天然藥物成分如黃酮類，生物堿，萜類，香豆素類成分分離分析中 的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用；天然產(chǎn)物；分離引言20世紀(jì)80年代，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展發(fā)生了大的飛躍，出現(xiàn)了很多軟電離技術(shù)， 如快原子轟擊電離子源(FAB)，基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)，電噴霧電離 源(ESI)，大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。APCI電離源的優(yōu)勢(shì)在于分析弱極性或中等 極性的小分子化合物，但是不適合大分子研究，主要應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)和藥物分析 等研究領(lǐng)域。ESI適用于中等極性到強(qiáng)極性的化合物，可用于分析在溶液

2、中能 事先形成離子的化合物和獲得多個(gè)質(zhì)子的蛋白質(zhì)、肽等大分子化合物。這兩種離 子源都具備使溶液氣化、樣品電離等性質(zhì)，成功地解決了液相色譜和質(zhì)譜之間的 接口問(wèn)題，使得液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)逐漸發(fā)展成為一種成熟的技術(shù)1。液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS) 是指液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的技術(shù)OHPLC是目前分離復(fù)雜體系最為有效的分析工 具，由于天然藥物中含有結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不同的多種復(fù)雜成分，而且有效成分的含 量往往較低，因此為了深入研究和開發(fā)天然藥物，必須從復(fù)雜的中草藥組分中提 取、分離鑒定出有活性的單體純樣，由于液質(zhì)聯(lián)用儀器自動(dòng)化、普及化程度愈來(lái) 愈高，已成為中藥分析最常用的儀器之一。1液質(zhì)聯(lián)用的特點(diǎn)1.1液質(zhì)聯(lián)用儀器的組成液質(zhì)

3、聯(lián)用儀是由HPLC、接口裝置、及MS三大單元組成。其中接口裝置是 關(guān)鍵。API接口是目前商品化LC-MS儀采用最廣的接口，主要包括電噴霧電離(ESI),離子噴霧電離(ISI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)三種操作模式。電噴霧電 離及大氣壓化學(xué)電離接口是一項(xiàng)實(shí)用、高效的常壓“軟”離子化技術(shù)，具有離子 化效率高、離子化模式多樣、可測(cè)定高分子量蛋白質(zhì)和熱不穩(wěn)定化合物、易與大 流量HPLC聯(lián)機(jī)使用等優(yōu)點(diǎn)，被人們稱為L(zhǎng)C-MS技術(shù)乃至質(zhì)譜技術(shù)的革命性突 破3。1.2液質(zhì)聯(lián)用分析的特點(diǎn)液質(zhì)聯(lián)用分析樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)化，使樣品分析更簡(jiǎn)便。對(duì)流速和流動(dòng)相 有一定的要求，流動(dòng)相應(yīng)使用純水及色譜純級(jí)試劑，其中禁止使

4、用任何無(wú)機(jī)酸、 鹵酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無(wú)機(jī)酸金屬鹽、表面活性劑及其它不可熱分解為氣體 的化合物，可使用甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、氨水，慎用氧氟酸。 流動(dòng)相中有必要使用揮發(fā)性鹽時(shí)，其濃度應(yīng)控制在20mM以內(nèi)，酸則控制在0.1% 以內(nèi)囹。HPLC-MS分析進(jìn)行的關(guān)鍵是液相色譜分析方法的建立及質(zhì)譜分析條件 的優(yōu)化。質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化則要根據(jù)目標(biāo)化合物的分子量及結(jié)構(gòu)、結(jié)合樣品濃 度、基質(zhì)特點(diǎn)及流動(dòng)相組成，調(diào)整質(zhì)譜掃描范圍，優(yōu)化多級(jí)碎裂電壓。1.3常用的液質(zhì)聯(lián)用儀器按照質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行分類，目前比較常用的HPLC-MS/MS儀器見表1。2天然藥物天然產(chǎn)物為我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與人類健康方面作出了重大

5、貢獻(xiàn)。中國(guó)現(xiàn)存最早的 藥學(xué)專著神農(nóng)本草經(jīng)，明朝李時(shí)珍編著的本草綱目以及清代趙敏學(xué)編著 的本草綱目拾遺就記載了大量的天然藥物。在我國(guó)，天然藥物又被稱之為中 草藥，它與中醫(yī)一起構(gòu)成了中華民族文化的瑰寶，是全人類的寶貴財(cái)富。天然藥 物之所以能夠防病治病，是因?yàn)榛谄湮镔|(zhì)基礎(chǔ)的有效化學(xué)成分起到了關(guān)鍵作 用。由于當(dāng)今世界國(guó)際化進(jìn)程加速，我們的中藥要走向國(guó)際市場(chǎng)就必須對(duì)其成分 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)性研究，這就必須借助現(xiàn)代化儀器，而液質(zhì)聯(lián)用儀器就是其中的一種， 在天然藥物成分如黃酮類，生物堿，萜類，香豆素類成分的分離分析中扮演了極 其重要的角色。表1常用的液質(zhì)聯(lián)用儀器質(zhì)譜檢測(cè)器適用范圍和特點(diǎn)單級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜儀適用于基質(zhì)中

6、無(wú)化學(xué)背景干擾的定性、定量分析，可通過(guò)離子源內(nèi)CID具有使離子誘導(dǎo)裂解實(shí)現(xiàn)“準(zhǔn) MS/MS ”功能，只能得到低分辨率的質(zhì)量數(shù)三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀可通過(guò)其MS/MS功能進(jìn)行定性分析或用選擇反應(yīng)監(jiān) 測(cè)(SRM)模式進(jìn)行定量分析。在所有的質(zhì)譜分析儀 中，QMS定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度最好。四極離子阱質(zhì)譜儀適合于目標(biāo)化合物、膚及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析及確認(rèn)， 但其定量分析能力在動(dòng)態(tài)范圍及穩(wěn)定度上皆不如四 級(jí)桿質(zhì)譜四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀結(jié)合四級(jí)桿質(zhì)譜的高靈敏度和TOF的高分辨率。傅里葉變換質(zhì)譜儀高靈敏度、高精度、高分辨率，在測(cè)定化合物時(shí)可 以準(zhǔn)確生成分子式，提供可靠的鑒定結(jié)果2.1黃酮類黃酮類化合物廣泛分

7、布于植物界，并具有較強(qiáng)的生物活性，例如抗菌作用、 抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或抗癌作用、解痙攣?zhàn)饔煤徒档脱獕鹤饔玫?。黃酮類化合物 不但在醫(yī)藥上有著廣泛的應(yīng)用而且在日常生活當(dāng)中可作為功能食品添加劑、天然 氧化劑、天然色素和甜味劑等。由于黃酮類化合物重要的藥用價(jià)值和保健作用， 對(duì)于復(fù)雜天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物進(jìn)行分離分析對(duì)其進(jìn)一步的研究工作起著 指導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)于其應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)也具有重要的意義。郭繼芬等選用 Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸為流動(dòng)相，經(jīng)紫外檢測(cè)后，在ESI掃描方式下， 對(duì)HPLC-UV圖譜中各色譜峰進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析，對(duì)照品比較鑒定了提 取物中4個(gè)已知的黃酮類化合物，推斷

8、出3個(gè)未知黃酮苷類化合物可能的結(jié)構(gòu)。Natividad等8采用LC - MS法對(duì)膠薔樹Cistus ladanifer L.葉分泌的樹脂進(jìn) 行分析，分離鑒定了芹菜素、4 -甲基芹菜素、7 -甲基芹菜素、7 , 4 -二甲基 芹菜素、3 -甲基山奈酚、3，4 -二甲基山奈酚、3，7-二甲基山奈酚、3，7， 4 -三甲基山奈酚等8個(gè)黃酮類成分。2.2生物堿類生物堿一般指存在于生物體內(nèi)的堿性含氮化合物，多數(shù)具有復(fù)雜的含氮雜 環(huán)，有光學(xué)活性和顯著的生理效應(yīng)。生物堿具有抗腫瘤作用的同時(shí)，對(duì)心血管 系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有一定的刺激作用，且還具有一定的抗菌、抗瘧作用10o 許多生物堿類已被提取分離，并用作臨床

9、治療藥物。Young-Hea Choi等凹采用 LC-ESI-MS-MS法分析了粗榧屬植物三尖杉 Cephalotax2us harringtonia葉中的生物堿，分離鑒定出三尖杉?jí)A、三尖杉酯堿、 高三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、去氧三尖杉酯堿、去氧三尖杉酸、高去氧三尖杉 酯堿、Cephalezomine C、Cephalezomine E等9個(gè)化合物。陳怡等12在蓮子心中 分離得到3種生物堿并做了定量分析和指紋圖譜研究。2.3香豆素類香豆素類是一類具有苯并邠比喃酮母核的天然產(chǎn)物的總稱。其在中藥中廣泛 存在，也具有多種生物活性，如茵陳中的濱蒿內(nèi)酯具有解痙、利膽的作用，蛇床 子中的蛇床子素可用于殺蟲

10、止癢等。孫秀燕等U3采用HPLC-MS/MS聯(lián)用儀， ESP-IT-MS對(duì)濱蒿中利膽保肝活性成分進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定出濱蒿中 的利膽有效成分除含有綠原酸、對(duì)羥基苯乙酮、6，7-二甲氧基香豆素。2.4萜類萜類指具有（C5H8）n通式以及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看成是由異戊二烯 或異戊烷以各種方式連結(jié)而成的一類天然化合物，是揮發(fā)油（又稱精油）的主要成分，從植 物的花、果、葉、莖、根中得到有揮發(fā)性和香味的油狀物。鄧亦峰等14采用HPLC- APCI-MS聯(lián)用技術(shù)，以選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM ）方式測(cè)定了半邊旗中二萜類化合 物，該方法可用于半邊旗中二萜類抗癌化合物的深入研究和生藥標(biāo)準(zhǔn)的制定

11、。2.5甾體類一般甾體結(jié)構(gòu)中具有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)，甾核C3位有羥基取代，可與糖 成苷，根據(jù)側(cè)鏈的不同，又分為c21甾類、強(qiáng)心苷類、甾體皂苷類和植物甾醇等。Tai等15用LC/ESI-MS/MS研究了蔓剪草中的C21甾體皂苷類，通過(guò)裂解 M+Na+離子，產(chǎn)生A、B、C和Y系列的離子，提供了糖鏈和苷元的結(jié)構(gòu)信息， 再輔以高分辨質(zhì)譜，鑒定了 8種C21甾體皂苷類。3展望綜上所述，HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)已在中藥化學(xué)成分分析、中藥質(zhì)量控制、中 藥代謝產(chǎn)物鑒定和中藥藥物動(dòng)力學(xué)研究等方面廣泛應(yīng)用。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)解 決了傳統(tǒng)液相檢測(cè)器靈敏度和選擇性不夠的缺點(diǎn)，提供了可靠、精確的相對(duì)分子 質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信

12、息，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，節(jié)省了樣品準(zhǔn)備時(shí)間和分析時(shí)間，特別是適 合親水性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子的分離分析，有著廣泛的應(yīng)用前景。 中藥及天然產(chǎn)物活性成分及其代謝物在生物樣品中濃度較低，且生物樣品內(nèi)源性 雜質(zhì)較多，對(duì)分析技術(shù)提出了很高的要求。日趨成熟的液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有靈敏 度高、特異性強(qiáng)以及操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，HPLC-NMR等聯(lián)用技術(shù)的補(bǔ)充，必將在 中藥與天然產(chǎn)物的定量分析、靶藥物成分的篩選以及藥物代謝物的鑒定等分析領(lǐng) 域發(fā)揮愈來(lái)愈不可替代的作用。參考文獻(xiàn)陳娟娟.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥用植物活性物質(zhì)分析研究中的應(yīng)用C.浙江大學(xué)博士學(xué)位 論文，2009： 4. 劉榮霞，果德安，葉敏，等.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(

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