酶法分析解析課件

1、Cha-4 酶法分析羧肽酶4.1 酶法分析的原理酶法分析:利用酶作為分析工具或分析試劑,測定樣品中用一般化學(xué)方法難以檢測的物質(zhì)（這些物質(zhì)可以是酶的底物，也可以是酶的抑制劑或活化劑以及酶的輔酶因子）的方法稱為酶法分析。根據(jù)測定原理，主要有終點法、反應(yīng)速率法、循環(huán)放大法等。4.1. 1酶的一般性質(zhì) 酶是生物催化劑。絕大部分酶是蛋白質(zhì)，還有一些核糖核酸RNA具有催化作用，稱為核酶（ribozyme）。 細胞的代謝由成千上萬的化學(xué)反應(yīng)組成，幾乎所有的反應(yīng)都是由酶（enzyme）催化的。 酶對于動物機體的生理活動有重要意義，不可或缺。酶在生產(chǎn)實踐中有廣泛應(yīng)用。高效性 酶的催化作用可使反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)

2、提高108 -1020倍。比其他催化反應(yīng)高106 -1013倍 例如：過氧化氫分解 2H2O2 2H2O + O2 Fe3+ 催化，效率為6104 mol/mol. S 過氧化氫酶催化，效率為6 106 mol/mol.S專一性 即對底物的選擇性或特異性。一種酶只催化一種或一類底物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的產(chǎn)物。酶的特點 酶容易變性 這是酶的化學(xué)本質(zhì)（蛋白質(zhì)）所決定的。酶的可調(diào)節(jié)性 抑制和激活（activation and inhibition ） 反饋控制(feed back) 酶原激活(activation of proenzyme) 變構(gòu)酶(allosteric enzyme) 化學(xué)修飾(chemic

3、al modification ) 多酶復(fù)合體(multienzyme complex) 已知的上千種酶絕大部分是蛋白質(zhì) 單純酶：少數(shù)，例如：溶菌酶 結(jié)合酶：大多數(shù) 結(jié)合酶 = 酶蛋白 + 輔因子 輔因子包括: 輔酶、輔基和金屬離子。酶的組成與維生素酶的化學(xué)本質(zhì)4.1.2酶法測定的原則1、酶活性 酶活性(enzyme activity) 指酶的催化能力， 用反應(yīng)速度來衡量，即單位時間里產(chǎn)物的增加或底物的減少。 V= dP / dt = - dS / dt 測定方法： 吸光度測定、氣體分析、電化學(xué)分析等。2、代謝物濃度3、酶底物復(fù)合物4.1.3 酶反應(yīng)動力學(xué)米氏雙曲線 米氏方程的推導(dǎo) 首先假設(shè)：

4、 1. 反應(yīng)在最適條件下進行 2. pH、溫度和酶的濃度是固定的,變化的是底物濃度 3. 反應(yīng)在起始階段，逆反應(yīng)可忽略 4. 反應(yīng)體系處在穩(wěn)態(tài)（stable state） E + S ES E + Pk+1k-1k+2 根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，在穩(wěn)態(tài)時，ES的生成速度與其分解速度相等。有以下關(guān)系式： V1=V-1+V+2 (1) k+1 E S = k-1 ES + k+2 ES = ES （k-1 + k+2 ） E S = ES （k-1 + k+2 ）/ k+1 (2) 令（k-1 + k+2 ）/ k+1 =Km (米氏常數(shù)) E S = ES Km (3) Et是自由酶E的濃度與結(jié)合酶ES

5、的濃度之和， 即 Et = ES +E (4) 總的反應(yīng)速度V應(yīng)該等于 V+2 = k+2ES (5) 將(4) ,(5) 代入 (3),整理得到 米氏方程: V=Vm S /(Km+S) V速度 Vm 最大速度 S底物濃度 Km 米氏常數(shù)米氏常數(shù)是反應(yīng)最大速度一半時所對應(yīng)的底物濃度當(dāng)Sm時，vm，呈零級反應(yīng) 米氏雙曲線某些酶的Km值 酶 底物 Km(mmol/L)乳酸脫氫酶 丙酮酸 0.017己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5-半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0碳酸酐酶 H2CO3 9.0過氧化氫酶 H2O2 25蔗糖酶 蔗糖 28糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108由米氏方程可知，

6、米氏常數(shù)是反應(yīng)最大速度一半時所對應(yīng)的底物濃度,即當(dāng)v = 1/2Vm時，Km = S米氏常數(shù)Km=(k-1+k+2)/k+1在反應(yīng)的起始階段，k+2 k-1，m k-1k+1 平解離此時，m越大，說明和之間的親和力越小，復(fù)合物越不穩(wěn)定。當(dāng)m越小時，說明和的親和力越大，復(fù)合物越穩(wěn)定，也越有利于反應(yīng)。米氏常數(shù)m對于酶是特征性的。每一種酶對于它的一種底物只有一個米氏常數(shù)。 米氏常數(shù)及其意義米氏常數(shù)的求法雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)方程和雙倒數(shù)曲線 4.1.4 酶法分析注意點 酶分析法是一種以酶為分析工具（或試劑）的分析方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化劑甚至酶的抑制劑。 酶分析法采用的條件和酶活力測定法

7、的條件基本相同，但其所用的酶量必須一定被測物以外的其他反應(yīng)成分均須保證處于恒定和最適。測定應(yīng)注意的問題。（1）被測物是酶的底物：當(dāng)?shù)孜餄舛萐km時，酶反應(yīng)相對底物而言具有一級反應(yīng)性態(tài)，即酶反應(yīng)速度與底物濃度成正比，ukS，因此測定酶反應(yīng)速度可以得知其濃度。（2）被測物是輔酶：需要NAD（P）、coA之類輔酶的反應(yīng)可看作是雙底物反應(yīng)，這些輔酶可看作是底物之一。當(dāng)另一類底物濃度足夠高時，反應(yīng)變?yōu)閱蔚孜锓磻?yīng)；那么反應(yīng)速度將與其成正比。以CoA的測定為例，它是-酮戊二酸脫氫酶的輔酶： 此反應(yīng)可通過340nm吸收度的變化來測定，當(dāng)另外二種底物處于足夠高的濃度時，反應(yīng)速度與CoA的濃度成正比。（3）被測物

8、為活化劑：當(dāng)其他條件最適且一定時，活化劑在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內(nèi)具有線性比例關(guān)系。但是用動力學(xué)方法測定時有兩個問題應(yīng)注意：活化劑濃度超過一定水平后常導(dǎo)致抑制；對于某一種酶，相似的離子往往也能表現(xiàn)出活化作用，因此測定不專一，易受到干擾。 （4）被測物是抑制劑：不可逆抑制劑對酶反應(yīng)產(chǎn)生的抑制程度，隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應(yīng)的最終抑制程度由抑制劑的絕對量決定?？赡嬉种苿┰诘孜餄舛纫欢〞r，在低的抑制劑濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低。例如，膽堿酯酶能用于檢測10l0g水平的有機磷化合物。這種測定應(yīng)注意的是：某些抑制劑能抑制多種酶；而有些酶

9、能被幾種相似的抑制劑所控制，因而如果“工具酶”選擇不當(dāng)，就易受到干擾。 對酶分析法來說，在建立了適宜的反應(yīng)和測定系統(tǒng)后，還必須制備一條酶反應(yīng)速度相對于相應(yīng)的被測物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便對未知樣品的量進行檢測。值得強調(diào)的是，在測定未知樣品時，所采用的反應(yīng)、測定系統(tǒng)和制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時所用的系統(tǒng)應(yīng)完全相同，而且待測樣品的濃度還應(yīng)控制在這一曲線范圍以內(nèi)。 4.1.5 酶法分析的發(fā)展的歷史過氧化氫：過氧化物酶。140年以前，麥芽提取物為酶源，以愈創(chuàng)木酚為共底物或指示劑測定。蔗糖：轉(zhuǎn)化酶。100余年以前，酶母提取液為酶源。尿素：尿酶。1914年。臨床實驗：轉(zhuǎn)氨酶。1958年，診斷肝病和心臟病。20世紀(jì)50年代

10、以前，近60種物質(zhì)能借助于酶法分析。進展：取決于能否以合理的價格提供純酶、底物和輔助因子。4.2 終點測定法紫外-可見分光光度法UV-VIS（略）4.2.1終點法的重要條件 又稱為平衡法或終點法。 根據(jù)被測物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對該物質(zhì)進行作用反應(yīng)后，借助物理化學(xué)方法測出其總變化量，計算出被測物的實際含量或濃度的一種分析方法。 終點法要獲得好的測定結(jié)果，重要條件是：被測底物的濃度應(yīng)很小，并控制反應(yīng)于1級反應(yīng)水平。因為這樣可以使反應(yīng)速度達到平衡點；防止過多的產(chǎn)物生成，避免逆反應(yīng)。其它因素應(yīng)盡量處于最適水平，雙底物反應(yīng)的另一底物應(yīng)具有足夠高的濃度。酶的用量要高，以保證反應(yīng)較快地達到終點。

11、 酶比較昂貴，因此有一個適宜的用量問題。一般而言，工具酶用量可控制在12 km單位（UmL）左右。而終點法的測定時間多控制在210min。注意點：底物特異性（絕對專一性、相對專一性）反應(yīng)的平衡(酶反應(yīng)的方向;提高第二底物濃度;pH;除去反應(yīng)產(chǎn)物；用具有不同平衡常數(shù)的輔酶類似物代替原用輔酶）S+NAD+ +H2O P+ NADH+ H+乳酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸S脫氫酶反應(yīng)液（酶量，第一反應(yīng)1km1,指示酶12個km指 ）反應(yīng)產(chǎn)物的抑制（反應(yīng)物除去；再生系統(tǒng)偶聯(lián))S+ ATP P+ ADP丙酮酸 丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸S激酶4.2.2 終點法種類1、一般酶反應(yīng)定量法（1）底物減少量的測定底物

12、能接近完全轉(zhuǎn)化，且具有特征性質(zhì)根據(jù)此原理可以定量的物質(zhì)有胞嘧啶（使用胞嘧啶脫氫酶反應(yīng)，測定280nm吸光度的減少）、腺嘌呤（原理同前）以及尿酸等。例1：尿酸的定量測定尿酸+2H2O+02 CO2+H2O2 +尿囊素 尿酸在293或297納米有特征吸收峰 尿酸酶試驗室尿酸定量測定的方法:0.1M 硼酸緩沖液(pH 9.5 )，0.3%甘油，45m M/L 豬肝尿酸酶，待測樣品（尿酸濃度在25mol/L以下）共四種組成反應(yīng)液，在室溫下放置15分鐘，然后再293nm在測定吸光度A；空白對照吸光度為A0。求得差值A(chǔ)1=A0 - A 另在同一波長下檢測與反應(yīng)液有相同濃度的尿酸酶的吸光度A2。則A3=A1

13、A2 代表系統(tǒng)由尿酸消失而引起的吸光度的減少。臨床血尿酸（UA）的測定 血液尿酸增高常見于腎臟疾病、痛風(fēng)、白血病與腫瘤及其他疾病如慢性鉛中毒引起的腎損害、長期禁食等酶比色法 尿酸酶催化UA氧化生成尿囊素和H2O2，過氧化氫在過氧化物酶的存在下與苯酚、4-氨基安替比林 氧化縮和成紅色醌式染料，此染料在500nm處有最大吸收峰，其吸光度值與UA含量成正比。例2胰蛋白酶效價測定 本品系自牛、羊、豬的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥品計算，每1mg的效價不得少于2500單位。 胰蛋白酶能專一地作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵，酰胺鍵及酯鍵。其水解速率為酯鍵酰胺鍵肽鍵。也可水解間位經(jīng)基苯甲酸

14、酶及脂肪酸酶，以及變性蛋白如酶蛋白、血紅蛋白。 可選用酪蛋白或含有堿性氨基酸的酰胺、酶等作為底物。目前均采用專屬性較高的 N-苯甲酰酰L精氨酸乙酯（BAEE）作為本品的底物。 樣品溶液的制備 精密稱取本品適量，用0.001mol/L鹽酸液溶解并制成每1m1中含5060胰蛋白酶單位的溶液。 底物溶液的制備 取N-苯甲酰-L精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液。 精密量取10ml，用磷酸鹽緩沖液（取0.067mmol/L磷酸二氫鉀溶液13ml與0.067molL磷酸氫二鈉溶液87ml混合，pH7.6）稀釋成100ml，恒溫于25.00.5，在253nm波長處，以水做空

15、白，測定吸收度，必要時可用磷酸鹽緩沖液（pH7.6）或上述底物原液調(diào)節(jié)，使吸收度在0.5750.585之間，作為底物溶液。底物溶液應(yīng)在制成2h內(nèi)使用。 檢測方法取底物溶液3.0ml與0.001molL鹽酸液0.2ml，混勻，作為空白。另取供試品溶液0.2ml與底物溶液（預(yù)熱至250.5） 3.0m1，立即計時并搖勻，比色池內(nèi)的溫度應(yīng)保持在25士0.5，在253nm波長處，每隔30s讀取吸收度，共5min。 吸收度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，作圖；每30s吸收度的改變應(yīng)恒定在0.0150.018之間，呈線性關(guān)系的時間不得少于3min。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品溶液的濃度，重新測定。在上述吸收度對

16、時間的關(guān)系圖中，取呈直線部分上的吸收度。影響本試驗效價測定的因素 （1）酶濃度：在固定底物濃度、反應(yīng)溫度、pH等條件下，調(diào)整反應(yīng)液的酶濃度是效價測定的關(guān)鍵，酶濃度過高或過低都不能使反應(yīng)速率保持恒定，最佳的測定濃度為5060IUml。 （2）溫度：溫度變化對酶促反應(yīng)速率較敏感，溫度每升高1，活力單位約增高5，反之，則下降。為準(zhǔn)確控制反應(yīng)溫度，除調(diào)節(jié)水浴溫度或室溫外，由于在測定時受儀器散熱和光照等影響，故必須隨時測量比色池內(nèi)反應(yīng)物的溫度，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （3）底物：因BAEE酶鍵易水解，其水溶液不穩(wěn)定，故該底物溶液應(yīng)在配制后3h內(nèi)使用BAEE底物測定本品酶活力，操作簡便，準(zhǔn)確度高，RSD

17、一般可控制在5以下。（2）產(chǎn)物增加量的測定 底物基本上都轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，而且產(chǎn)物又具有專一地進行定量測定的性質(zhì)。借助相應(yīng)的專一脫羧酶，再用瓦式呼吸計測定生成的CO2，如各種氨基酸草酸等在某種酶的作用下，形成的產(chǎn)物具有特征的吸收譜帶，如黃嘌呤和次黃嘌呤等。例1：草酸的定量測定草酸 芥子苷（227.5 nm無吸光度） 烯丙基異硫氰酸（227.5 nm下具有最高吸光度）草酸脫羧酶芥子苷酶甲酸 + CO2例2 胃蛋白酶的活力測定自豬、羊或牛的胃粘膜中提取的胃蛋白酶，具有催化蛋白質(zhì)水解的能力。 在實驗條件下，胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用水解產(chǎn)物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酶氨酸和

18、色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接測定，并計算出本品的酶活力。每1g檢品中含蛋白酶活力不得少于 3800單位。 對照品溶液的制備 精確稱取經(jīng)105干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液（取1molL鹽酸溶液65時，加水至1000ml）制成每1ml中含05mg的溶液。 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，用上述鹽酸溶液制成每1ml中約含0.20.4單位的溶液。 測定法 取試管6支，其中3支各精確加入對照品溶液1時，另3支加入供試品溶液1ml，置37土0.5水浴中，保溫5min，加入預(yù)熱至37 0.5的血紅蛋白試液5ml，搖勻，并精確計時，在37土0.5水浴中反應(yīng)10min。 立即加入5三氯醋

19、酸溶液5ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置370.5水浴中保溫10min，再加入5三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液 1ml，另1支加上述鹽酸溶液1ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，（測定時，濾液須澄清，否則將影響結(jié)果的準(zhǔn)確度及精密度。 ） 分別作為供試品和對照品的空白對照，照分光光度法，在275nm的波長處測定吸收度，算出平均值A(chǔ)s和A。在上述條件下，每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1mol酶氨酸的酶量，為一個蛋白酶活力單位。 本法是通過酶促反應(yīng)動力學(xué)和正交試驗研究，確定酶和作用物的濃度、反應(yīng)時間、溫度和pH等最佳反應(yīng)條件而建立的，具有靈敏度高、操作簡

20、便等優(yōu)點。例3 肌酐(CREA) 的測定肌肝+H2O 肌酸肌酸+ H2O （肌酐酶） 肌氨酸+尿素肌氨酸+ H2O+O2氨基乙酸+ H2O2+甲醛H2O2 + 苯酚 + 4-氨基安替比林 醌亞胺（紅色）4H2O 醌亞胺在500nm處有最大吸收峰，其吸光度值與CREA含量成正比。其他酶比色法舉例1.血清膽固醇測定 用于評估動脈硬化的風(fēng)險以及對脂類/脂蛋白的代謝紊亂進行診斷和監(jiān)測治療。 增高見于糖尿病昏迷患者，原發(fā)性高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、腎病綜合征等。 降低見于惡性貧血、溶血性貧血、甲狀腺功能亢進、感染、營養(yǎng)不良、肝硬化、急性肝壞死等。 膽固醇酯在膽固醇酯酶的作用下分解生成膽固醇，膽固醇在膽

21、固醇氧化酶及過氧化物酶作用下最終生成醌亞胺，醌亞胺的顏色深淺與膽固醇的濃度成正比。2.甘油三脂TG 甘油三酯的升高與冠心病的發(fā)生也有很大關(guān)系。增高：脂肪肝、阻塞性黃疸、動脈粥樣硬化、高脂血癥等；降低：嚴(yán)重肝衰、甲狀腺功能減退等磷酸甘油氧化酶法 甘油三脂在脂肪酶、甘油激酶等酶的作用下，生成3-磷酸甘油，再經(jīng)磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化生成磷酸二羥丙酮和過氧化氫，過氧化氫與4-氨基安替比林在過氧化物酶作用下生成紅色醌類化合物。其顯色程度與TG成正比。（波長500nm）3、游離脂肪酸FFA游離脂肪酸在乙酰輔酶A合成酶(ACS)和乙酰輔酶A氧化酶(ACO)的作用下，生成過氧化氫（H2O2）。生成的過氧

22、化氫（H2O2）在過氧化酶和顯色劑的作用下產(chǎn)生美蘭，美蘭在一定光波長具有吸收峰，吸光度的大小與游離脂肪酸的濃度成正相關(guān)。（3）當(dāng)?shù)孜锘蚍磻?yīng)產(chǎn)物都沒有易于鑒定的吸收帶時引入輔助酶和指示劑構(gòu)成的酶系怎么辦？被測底物指示劑酶的底物(Pn)NAD+260 nmNADH340 nmPnH2引發(fā)酶輔助酶技術(shù)關(guān)鍵批示劑酶的量遠超過輔助酶的量。使用過量的反應(yīng)物:NAD(P) 或 NAD(P)H，是被測組分濃度的5-10倍，甚至100倍（乳酸脫氫酶測定乳酸）。改變pH：丙酮酸pH7.6，乳酸pH9.5采用一種捕集劑：與非指示劑產(chǎn)物作用，如乳酸測定中加入肼捕集丙酮酸（產(chǎn)物）改變反應(yīng)物：加入共底物，改變平衡常數(shù)，利

23、于有副反應(yīng)伴隨的反應(yīng)過程的測定。例：L-谷氨酸的定量測定（NADH 生成量的測定）L-谷氨酸 +NAD+ +H2O-酮戊二酸 +NADH +NH4 +谷氨酸脫氫酶 此反應(yīng)平衡偏向左方，可添加肼捕捉酮酸，并加過量的NAD+ ，反應(yīng)在堿性條件 p H 9下進行，谷氨酸濃度在60 mol/L以下時,反應(yīng)基本定量的向右進行. 方法：將含有0.3 甘氨酸-肼緩沖液（用硫酸調(diào)至p H 9）、1.0mmol/L ADP、1.6m - NAD、樣品（含谷氨酸在60 mol/L以下）以及155g(4.5U)/ml 以上的谷氨酸脫氫酶的反應(yīng)液（3.35ml)置于光學(xué)檢測系統(tǒng)中，在340nm處測定添加NAD 后60

24、分鐘的吸光度（A1）；另外以不加酶的相同溶液系統(tǒng)作為空白，同樣在NAD添加后60分鐘（和反應(yīng)液測定時間要剛好相同）測定340nm的吸光度（A2）， NAD 和肼能夠形成在紫外區(qū)有吸收的絡(luò)合物，所以空白值相當(dāng)高，這種絡(luò)合物的形成在開始時很快，以后逐漸減慢，所以如果時間不一致，就會產(chǎn)生誤差。 A=A1-A2 與NADH 的生成量相對應(yīng)，故根據(jù)NADH的吸光度可以算出NADH 的實際生成量，進而求得谷氨酸量。2、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)測定法這種定量方法常用于以下二種情況：一是反應(yīng)產(chǎn)物和底物在用物理化學(xué)手段無法區(qū)別時，往往可借助酶來加以識別，在這種情況下，如該酶可用做指示酶反應(yīng)，則就有可能能過和它耦聯(lián)進行定

25、量分析。二是測定反應(yīng)所用酶的專一性不高，而樣品中又夾雜著能作為它們的底物的其化物質(zhì)，這時往往只用一種酶進行定量是困難的，可以再耦聯(lián)一個酶，通過耦聯(lián)酶的專一性加以區(qū)別定量。根據(jù)耦聯(lián)的指示酶反應(yīng)所用酶的不同分為以下二大類： （ 1）以脫 氫酶為指示亮劑 用為作為耦聯(lián)指示劑的酶中應(yīng)用得最廣泛的是以NAD或NADP為輔酶的脫氫酶。 例1： 1磷酸葡萄糖（G1P）的定量測定 將磷酸葡萄糖變位酶反應(yīng)與G6P脫氫酶反應(yīng)耦聯(lián)，因NADPH的生成量同G1P的減少量成正比例，因此可以通過340nm吸收度的測定量G1P。 方法： 將含有88mmol/L三乙醇胺緩沖液（pH7.6）、1.7mmol/L EDTA、4.

26、4mmol/L Mg2+ 、0.5mmol/L NADP、樣品和G-6-P脫氫酶混合液 放置反應(yīng)5分鐘，測定吸光度A1，然后加入變位酶約4分鐘后測定吸光度A2，根據(jù)A2-A1可計算G-1-P 的量。G-1-PG-6-P磷酸葡萄糖變位酶1，6-二磷酸-葡萄糖G-6-P6-磷酸葡萄糖醛酸 + NADPH + H+6-磷酸-葡萄糖脫氫酶1，6-二磷酸-葡萄糖對于此共存的混合液來說，用乳酸脫氫酶作用時，反應(yīng)定量地向右進行，根據(jù)340nm吸收度的減少便可算出丙酮酸量；如再加丙酮酸激酶，使丙酮酸激酶反應(yīng)與乳酸脫氫酶反應(yīng)成偶聯(lián)反應(yīng)，則NADH 的減少和磷酸烯醇式丙酮酸量成正比；進一步加烯醇化酶，使烯醇化酶反

27、應(yīng)和丙酮酸激酶及乳酸脫氫酶偶聯(lián)，則NADH 的減少與D-2PGA 的量成正比。（反應(yīng)在一個比色杯中進行）D-2PGA（D-2-磷酸甘油酸）例2： 丙酮酸、磷酸烯酸丙酮酸和 D-2-磷酸甘油酸的定量測定PEP（磷酸烯醇丙酮酸）PEP + ADP 丙酮酸 + ATP丙酮酸 + NADH+ H+乳酸 + NAD+烯醇化酶丙酮酸激酶乳酸脫氫酶（LDH）（2）脫氫酶以外的酶脫氫酶類作指示酶使用最廣泛，其他還有少量，例如參與色素氧化還原的酶。例如p-79 的D-葡萄糖和L-谷氨酸的定量測定4.3 反應(yīng)速度法優(yōu)點：測定速度較高（1-5 min)；成本較低，酶用量較少；不致于因酶制劑不純而產(chǎn)生嚴(yán)重的誤差；不需

28、要考慮反應(yīng)是否進行完全；易于安排自動測定。方法：斜率法；固定濃度或變化時間法；固定時間法4.3.1 幾種反應(yīng)速率法斜率法測定反應(yīng)物（被測組分）、產(chǎn)物或指示劑的濃度隨時間變化的曲線，曲線的起始斜率由外推至?xí)r間為零而得。酶濃度固定時，測得的斜率與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。測定參數(shù)：吸光度、熒光度、pH例如: 2,3-二磷酸甘油酸 的定量測定 肝素的定量測定尿素(UREA)的測定臨床實驗室常采用脲酶速率法 脲酶催化尿素水解產(chǎn)生NH3和CO2。在谷氨酸脫氫酶催化下，NH3與-酮戊二酸和NADH反應(yīng)生成NAD+。NADH在340nm處有特異性吸收峰，通過測定NADH下降速率與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)比較，得出尿素含量。其

29、他方法固定濃度（變化時間）法記錄使反應(yīng)物（被測組分）或產(chǎn)物達到額定濃度所需時間。測定指標(biāo)：所有能顯示出反應(yīng)物濃度的任何理化特征，如吸光度、熒光度、pH時間與反應(yīng)物濃度成反比。變化時間法自動化測定：反應(yīng)由注入酶而開始。30 s后自動計時。當(dāng)吸光度或熒光度達到額定值時，計時器自動關(guān)閉。被測組分實際濃度與所需時間成反比。固定時間法反應(yīng)進行一額定的時間間隔后，依據(jù)理化特性的變化測定其中某一反應(yīng)物或產(chǎn)物的濃度變化。4.3.2 連續(xù)檢測法醫(yī)藥學(xué)上主要血清酶學(xué)檢查，如各種肝臟和腸道酶的異常改變。例1 谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶，ALT） ALT催化L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，生成丙酮酸。 丙酮酸與NADH在LD

30、H的催化下反應(yīng)生成乳酸和NAD+。NADH在340nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清中ALT的活性成正比，在340nm處測定NADH下降速率，即可測出ALT活性。例2 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶，AST）AST催化L-天冬氨酸的氨基轉(zhuǎn)移與MDH催化的反應(yīng)偶聯(lián)，使NADH氧化生成NAD+。NADH在340nm處有特異吸收峰，其被氧化的速率與血清中AST的活性成正比，在340nm處測定NADH下降速率，即可測出AST活性。例3 堿性磷酸酶（ALP）的測定（膽道梗阻的酶）連續(xù)監(jiān)測法 無色的對-硝基苯磷酸二鈉在ALP作用下，生成在405nm處有特異吸收峰的淡黃色對-硝基苯酚，通過測定在40

31、5nm處吸光度的變化速率計算ALP活性。4 -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的檢測原理：GGT分布在膽管或膽道系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測法 r-谷氨酰-3-羧基-對硝基苯胺和雙甘肽在-GT作用下，生成對硝基苯胺及r-谷氨酰雙甘肽，所釋放出的對硝基苯胺與-GT活性成正比，通過在405nm處測定對硝基苯胺的變化，可求出-GT活力。4.4 酶循環(huán)放大法 是一種超微分析法，利用底物的專一性，使微量的底物“增幅放大”以達到定量目的。4.4.1 循環(huán)放大原理基本步驟 轉(zhuǎn)換反應(yīng)：以試樣中的待測組分為底物，經(jīng)特異反應(yīng)生成與待測組分相應(yīng)的定量循環(huán)底物。 循環(huán)反應(yīng)：生成的循環(huán)底物反復(fù)參加兩個酶反應(yīng)組成的偶聯(lián)反應(yīng)，所得產(chǎn)物量為循環(huán)底物的

32、若干倍。 指示反應(yīng)：采用酶法測定反應(yīng)產(chǎn)物。由反應(yīng)產(chǎn)物量及循環(huán)次數(shù)，計算出循環(huán)底物量，再推算試樣中待測組分的量。 以超微量前列腺素（PG ）的定量分析加以說明。 1.轉(zhuǎn)換反應(yīng) 試樣中的PG在過量NAD存在下，經(jīng)前列腺素脫氫酶（PGDH）催化進行轉(zhuǎn)換反應(yīng)。生成與PG相當(dāng)?shù)腘ADH。PG + NAD+15-脫羧-PG + NADH + H+PGDH 2.循環(huán)反應(yīng) 用一定方法除去剩余的NAD后進行循環(huán)反應(yīng)，在過理的3磷酸甘油醛 酮 二酸和銨鹽存在下，經(jīng)磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和谷氨酸脫氫酶（GDH）催化。NADH被氧化成NAD，并生成與NADH量相當(dāng)?shù)墓劝彼?。隨后，NAD又被還原成NADH，并產(chǎn)

33、生與NADH量相當(dāng)?shù)?磷酸甘油酸。如果反復(fù)進行n次，則蓄積的谷氨酸及3磷酸甘油酸的量即n倍于NADH。 3.指示反應(yīng) 蓄積的谷氨酸在過量NAD存在下，經(jīng)谷氨酸脫氫酶能進行指示反應(yīng)。利用終點法測得谷氨酸的量。 由谷氨酸的量及循環(huán)次數(shù)n則可求出待測物PG的量。 在循環(huán)反應(yīng)中各成員的濃度應(yīng)符合一定的要求。底物Sa和Sb的濃度比相應(yīng)酶Ea和Eb的米氏常數(shù)值為大。循環(huán)底物A 和B 的濃度（與待測組分濃度相當(dāng)/應(yīng)比相應(yīng)酶Ea和Eb的米氏常數(shù)值要小。谷氨酸 +NAD+ -酮戊二酸 +NADH+H+GDH反應(yīng)4.4.2 循環(huán)反應(yīng)是關(guān)鍵高靈敏，較強特異性。NAD 循環(huán)，NADP循環(huán)，CoQ循環(huán)等4.4.3 舉例

34、葡萄糖 +ATP6-磷酸-葡萄糖 + ADPHK（己糖激酶）6-磷酸-葡萄糖 +NADP+6-磷酸-葡萄糖醛酸 + NADPH + H+G6PDH膽汁酸測定酶循環(huán)法 膽汁酸被3-羥基類固醇脫氫酶及Thio-NAD特異性地氧化，生成3-酮類固醇及Thio-NADH，3-酮類固醇在3-羥基類固醇脫氫酶及NADH存在下，生成膽汁酸和NAD，循環(huán)往復(fù)從而放大微量的膽汁酸量，測定生成的Thio-NADH的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)比較，得出膽汁酸含量。臨床意義血清總膽汁酸升高肝損害：肝炎、肝硬化、肝癌膽道阻塞：膽管梗阻門脈分流4.5 生物傳感器與酶傳感器4.5.1 生物傳感器生物傳感器(Biosensor)是指用固定

35、化的生物體成分或生物體本身作為敏感元件的傳感器，是一種將生物化學(xué)反應(yīng)能轉(zhuǎn)換成電信號的分析測試裝置。轉(zhuǎn)換器敏感元件待測物生物傳感器的模型是一門由生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透成長起來的高新技術(shù)。應(yīng)用領(lǐng)域：環(huán)境監(jiān)測、食品分析、生物醫(yī)學(xué)一、概述1. 定義敏感材料由生物體成分（或本身）組成的傳感器利用生物活性物質(zhì)具有的分子識別功能，專一、靈敏。敏感元件：酶、抗體、核酸、細胞等。轉(zhuǎn)換器：電化學(xué)電極、光學(xué)檢測元件、場效應(yīng)晶體管、壓電石英晶體、表面等離子共振。酶 (Enzyme)抗體(Antibody)DNA 2. 分類根據(jù)輸出信號產(chǎn)生的方式 生物親和型、代謝型、催化型根據(jù)生物分子識別元

36、件上的敏感物質(zhì) 酶傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、基因傳感器等根據(jù)信號轉(zhuǎn)化器 電化學(xué)生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器等其他分類 被測對象、大小、功能3. 生物傳感器的特點 高選擇性。生物傳感器是由選擇性好的主體材料構(gòu)成的分子一識別元件，因此，一般不需進行樣品的預(yù)處理。測定時一般不需另加其它試劑。 體積小、可以實現(xiàn)連續(xù)在位監(jiān)測。 響應(yīng)快、樣品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反復(fù)多次使用。 傳感器連同測定儀的成本遠低于大型的分析儀器，因而便于推廣普及。4.5.2電化學(xué)生物傳感器的分類（根據(jù)敏感物質(zhì)分類）酶傳感器免疫傳感器組織傳感器、細胞傳感器等 （一）酶傳感器酶電極電化學(xué)電極頂端緊

37、貼一層酶膜朱建中,周衍.傳感器世界.1997,4:18 1、酶的固定化技術(shù)惰性載體物理吸附法離子載體交換法活化載體共價結(jié)合法物理包埋法物理吸附法酶分子通過極性鍵、氫鍵、疏水力或電子相互作用等吸 附于不溶性載體上。常用的載體有：多孔玻璃、活性炭、氧化鋁、石英砂、纖維素酯、葡聚糖、瓊脂精、聚氯乙烯、聚苯乙烯已用此法固定化的酶如： 脂肪酶、D葡萄糖苷酶、過氧化物酶等 交換法 選用具有離子交換劑的載體，在適宜的pH下，使酶分子與離子交換劑通過離子鍵結(jié)合起來，形成固定化酶。 常用的帶有離子交換劑的載體如下： DEAE一纖維素、TEAE一纖維素、 AE纖維素、CM纖維素、 DEAE一葡萄糖、肌酸激酶共價結(jié)

38、合法a .重氮 b.迭氮 c.鹵化氰 d.縮合e.烷基化法 物理包埋法 將酶分子包埋在凝膠的細微格子里制成固定化。 常用的凝膠有：聚丙烯酸胺、淀粉、明膠、聚乙烯醇、海藻酸鈣、硅樹脂 用凝膠包埋法制備的固定化酶如：木瓜蛋白酶、纖維素酶、乳酸脫氫酶2.酶電極及酶傳感器實例生物分子識別元件：葡萄糖氧化酶膜可用的測量量：O2的減少量，葡萄糖酸或H2O2的產(chǎn)生量信號轉(zhuǎn)換元件：氧電極，pH電極及H2O2電極（1）葡萄糖氧化酶電極一種葡萄糖傳感器-GlucowatchGlucose pulled through the skin by charged molecules The ions migrate t

39、o the anode (+) and cathode (-) Glucose reacts with glucose oxidase to form hydrogen peroxideThe reaction produces an electrochemical measured by the AutoSensor葡萄糖傳感器應(yīng)用（1）葡萄糖傳感器大腸桿菌改良型葡萄糖傳感器MWCNTs-HRP葡萄糖傳感器檢測血清中葡萄糖濃度大腸桿菌改良型葡萄糖傳感器利用大腸桿菌中的葡萄糖脫氫酶(mGDH)對氧分子的不敏感性而降低干擾。此傳感器把大腸桿菌細胞固定在附有苯醌的石墨電極上，中間夾有一層透析膜。檢

40、測葡萄糖濃度達0.2-10 mM ，響應(yīng)時間在2min左右，此葡萄糖傳感器用EDTA處理后可再度使用。Ito Y, Yamazaki S,Biosens Bioelectron.2002 , 17(11-12):993-8MWCNTs-HRP葡萄糖傳感器施加電壓為-300mv時，可避免抗壞血酸、尿酸等干擾，對葡萄糖在GOD作用下生成的過氧化氫有高的靈敏度。MWCNTs和HRP混合物固定在電極上，制成MWCNTs-HRP改進型電極。檢測限達1.0 x 10(-7) mol/L,還可在線檢測葡萄糖。Yamamoto K , Shi G . Analyst . 2003 ,128(3):249-54

41、檢測血清中葡萄糖濃度在普通葡萄糖電極上加一層多功能膜，使測量不受血液中其它金屬離子以及抗壞血酸、尿酸等干擾物質(zhì)的影響。此多功能膜為磷酸膽堿，甲基丙稀酰胺和纖維素的聚合物。檢測血清中葡萄糖濃度達5-650 mg/dl，響應(yīng)時間小于60s，有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。 Chen CY , Ishihara K.Biomed Microdevices.1998 , 1(2):155-66（2）脲電極Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲 酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應(yīng)。此外還有：氨基酸電極醇電極尿酸電極乳酸電極青霉素電極亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3生物分子識別元件：乙醇氧化酶膜信號轉(zhuǎn)換元件：氧電極（3）乙醇傳感器生物分子識別元件：乙醇脫氫酶膜信號轉(zhuǎn)換元件：Ox 電子傳遞介質(zhì)（二茂鐵、四硫富瓦烯）15秒，10-610-4 mol/L生物分子識別元件：丙酮酸氧化酶信號轉(zhuǎn)換元