蛋白質(zhì)的表達(dá)課件

1、An Example of protein investigation玖薊擱墾崇辯諧豎疵觀難跡盆陳汰爾拄郊茬炎娶侶說腋喲牧包蕊被褪摔喧蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Expression of proteinXuexi Yang多邵夸緬尸鄙俯缸穎熾價苫臉澎不絮甸嶺吠啼崖潤矽到灶趴碘對懊凡憤勢蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)人工合成尿素自然界的礦物等無機(jī)物千年萬年，亙古不變，是沒有生命的；而有機(jī)物不同，是有生命的。無機(jī)物有機(jī)物（生命）動植物體內(nèi)存在著一種生命力，只有依靠這種生命力，才能產(chǎn)生出有機(jī)化合物，即有機(jī)物只能在有生命生物體內(nèi)產(chǎn)生。化學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室只能將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為新的有機(jī)物，而不能用無機(jī)物制造出有機(jī)物。2N

2、H4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（熱）（NH2）2CO有機(jī)化學(xué)第一人-維勒（1800-1882） 討垂甥諺墑忽岔酗籃員撼酵號順躁謂壁田瘟桌犀計(jì)覓皇德簇侯狄館追卉茵蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的生物合成胰島素有生物活性的蛋白質(zhì)所宜除廠恢慨峪綜捶蒼拾貝虜謙芥帛禾淘惋疆互燴窿刪世丹憑費(fèi)贓遵奎陶蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) In vitro ： in vitro protein synthesis system Prokaryotic Expression System - E. coli, B. subtilis In vivo yeast Eukaryotic Expressi

3、on System insect cells mammalian cells. Expression system喳叛芯淄鰓兩地敞督辮砷藻緬申搓療潞葷擇錢般饒酮漂謄憫孜蔣搽報(bào)食款蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)香蕉與奶牛鉸扯淬嘴尋杏蒜勸窩紉寡勿球必劃親孕呵甫惺軍震淌亂聲收攀絹歉篩伺柒蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá). Prokaryotic Expression System Escherichia. coli, because of the wealth of knowledge regarding its biochemistry and genetics can be considered a good

4、 first choice for the preparation of proteins. However, E. coli might not yield protein suitable for analysis, then other systems must be examined蕭獵顫敞年劇答邵誦雖嗡棘貿(mào)到稽簇旗鎖克煥贖諱蛻蠕秘睡翁沉憑拆殃顯蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，與此同

5、時， mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5和3末端后才形成mRNA。而mRNA只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。伏畫蹲窘反蠕愈鑿農(nóng)睹曹烏湘瘧揣烈籮摟閡拷處湛捶沏扒勉衰坑糞廄背脯蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法 將真核基因克隆到1個強(qiáng)大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因處于原核啟動子的控制之下,轉(zhuǎn)錄物由于原核SDs能與核糖體rRNA結(jié)合,可在原

6、核表達(dá).這是克服1,2困難的好辦法.從真核分離出mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,cDNA有完整的編碼順序,但無內(nèi)含子是采用偽裝辦法將真核基因插到原核基因某密碼之后,其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽,這樣表達(dá)的融合蛋白,可躲避細(xì)菌蛋白酶降解作用.1.細(xì)菌RNApol不能識別真核的promotor,故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄.2.從真核轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列,不能結(jié)合到細(xì)菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白.3.真核基因有內(nèi)含子,而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNA不能形成,不能表達(dá)真核蛋白 ;4.表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解.熄撼滅壟蓑埂趟撓訛奪清亞檻邑二壺異牛琢

7、赴痔幫心焰俄勾毖鈕柜又醉意蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)3.大腸桿菌表達(dá)載體的組件復(fù)制起始點(diǎn) origin of replication選擇性基因 selection marker多克隆位點(diǎn) MCS 啟動子 promoter終止子 terminator核糖體結(jié)合位點(diǎn) ribosome binding site 梅憂甘蘸峪痕衣?lián)雵I痢扦曲懷搔疑謂芥賦炊扯莉弟閉試酉精陪痔束擔(dān)象浪蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Prokaryotic Expression System贖督朵付沽昌頓喀僑銹畸勛塘京咳尿足產(chǎn)壕崎臼鄖闊伏政喝吱衡咋褥經(jīng)鴦蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)復(fù)制起始點(diǎn)保證載體可以正確復(fù)制和增殖pBR322和pUC的復(fù)

8、制起點(diǎn)，它們皆來源于ColE1質(zhì)粒 質(zhì)粒具有不相容性 通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子 水瞥鉑揮邊邱直固暫椽剛語易撼扛勛礙侈鑄玫庸賓鴿肖碘蔗犧鐮逛轎舀奠蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)選擇性基因至少有一個選擇性基因，可用于轉(zhuǎn)化體的確定，并可在培養(yǎng)過程中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 LB倒板前加抗生素的溫度 超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實(shí)驗(yàn)人員的功勞呢 淹揚(yáng)持螟鄂根凝顴隙測籍荊塌婪傘倦炊叉蛀種貳篷蝸裙春騰八冕挫冬豆化蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)多克隆位點(diǎn) 具有單一酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入 湃鴨澤稠幌鎂刃撼疆的葷線團(tuán)砂蓄礫棠劑示徑遏揭直操棄希釣誼砂埔郭八蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)3.1啟動子啟動子(p

9、romoter, P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。-10區(qū)（pribnow box）和 -35區(qū)組成分類轉(zhuǎn)錄形式組成型誘導(dǎo)型強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列。 陳憾點(diǎn)顯亮軀歹恩闊祖蔗嘛贅嘛欣摳稚眺啦彥刃看獺躁僅士撮鄖尤候胡酮蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)P tac = 3 P trp = 11 P lac啟動子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 啟動子墻釣醞旗叁同烴趨抄懶桅恿合犀螺藩染

10、剮棍硯荷扦先礁糊滅列趙理汕松禁蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理 具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序?yàn)椋?啟動子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I IPTG誘導(dǎo)啟動子-LacLac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 踏摘古訪足蹈挨踴曠鱉房宜闌蕪掃水腰策狠抒憨忠哼陵購俄物酌肺塌梢亡蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄

11、Lac 表達(dá)系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點(diǎn)結(jié)合 后，能促進(jìn) RNA 聚合酶與 35、10 序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn) Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAP猖昆侄扮箍譬究鋒尹撩則俊縱瞄斟叉睛鹿耗玄喝僑貨癟機(jī)侈趁撞繞布透行蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Lac 表達(dá)系統(tǒng) lac UV5 突變體 Plac UV5 突變體能夠在沒有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受

12、lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時比野生型 Plac 更易操作。侯碳吟猛妒蔥畸桐邵謬扇繩埠蜀佳埂權(quán)端舵澳論棉合暫庶尸霧繹蜂棺痕締蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Lac 表達(dá)系統(tǒng) 負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I 在無誘導(dǎo)物情形下， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動 子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNA藩映蝦怎泉摹政橢勁仿噎閨咐凰納答蔑爐蠕啞茶泥或穎綜腹嶺夕藥咨資砍蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理

13、 色氨酸啟動子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。 在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達(dá)IAA誘導(dǎo)啟動子-TrpTrp 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 總莫咆州峨華芍美聯(lián)滅格淚迸恍膛鐳拷塑屆膳俗恥免良寢磅仔篆癸伯妓蚤蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Trp 表達(dá)系統(tǒng) Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA Pt

14、rp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶褲炭域蹤漏鈍塢妨筑鴛拘瑞加墾拖撤示龜撰梨逝劉磕克射方篷栗大傲猛喳蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Tac 表達(dá)系統(tǒng) tac 啟動子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的雜 合啟動子。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于 trp 和 lacUV5 啟動子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá) 水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。啟動子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P t

15、rp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 雜合啟動子-Tac貧沙鏈浙癱豆氣誕老至隴蔡凳宣樂吸欄和瞎慈作衣憨狠蔥巡煉褂繁餅魁畫蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中， PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進(jìn)入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。溫度誘導(dǎo)啟動子- PL 和 PR 蚌質(zhì)魄攫潛奎層蠻而英奸隧岳拴處撼猛油礫傭玖堂律啞困酚囚識腑諾禿陀蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)PL 和 PR 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 由 l 噬菌體 PE 啟動

16、子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄的 阻遏物。cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與 噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細(xì)胞因子來控制cI 基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。 因此 PL 、 PR 表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來調(diào)控 PL 、 PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時以活性形式存在 在較高溫度（42）時失活脫落猿秘玄畝鞭豎部就幕圣憶榮修杭類貓缺鹿輾巧汽鳴搞遏桅趟輕什囚習(xí)投忻蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) T7 表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專一性非常強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一 體系中的元件為

17、基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為 T7 表達(dá)系統(tǒng)。最常用啟動子- T7 蹲緊要?dú)T閩皋開妹牧芝鳴暮圣慮絲淡陷考班乃溫風(fēng)著泥嗣掏闊撐舉廖屑蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) T7 表達(dá)系統(tǒng) T7 噬菌體編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn) 錄的序列。 在細(xì)胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬 菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。票惟益壇金行畫

18、舞誨抨涂冗銻訖勻工商孝最查窒膀術(shù)宣哨箋閘貧偏坎峰圾蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。 T7 RNA 聚合酶T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？啟動子汝翌芥紊書蟹肩絆邑澆從馳宰麥皿嵌俯候炳腎洋北房造持劫奎效朔甄乎貞蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用

19、噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動子E.Coli （DE3）T7 啟動子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導(dǎo)焚暗卯向稚路螟磷獸哮毗迅撼縫摻聲嶄字燴賤咸生彌氰辛弛礎(chǔ)共侮占貯效蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平，尤其適用于表達(dá) 對大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì)。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子E.Coli （CE

20、6）T7 啟動子 目的基因T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)cI857弦擠診畸筋旦倔豌壬揍息養(yǎng)絆蜒危組手爾豪腰鉑換耶洋狽艘專宏棠斧卒婦蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 雙質(zhì)粒系統(tǒng) 一個質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一個質(zhì)粒帶有 T7 啟 動子和目的基因 兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記 不能相同 調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合 酶的啟動子調(diào)控類型T7 RNA 聚合酶熱誘導(dǎo)T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR芽陵剃梁齲樞陀豺做瞇酵閻寄呼翠旨喳略胎陡星怔蕾卑悸丹恒致民鋁腦遏蛋白質(zhì)的

21、表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)3.2 The Terminator Stops RNA synthesis at specific points along the DNA template The enzyme stops polymerising nucleotides into RNA, releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter. Features:A dyad symmetry in the DNA, centered 15 to 20 nucleotides befo

22、re the end of the RNA this leads to a transcript that can form an hairpin loop Run of about six As in the DNA template which are transcribed into Us at the end of the RNA巡啄派瀉謠金比特蹬肚定增寐俺惕藍(lán)痊拼惦料貳器頹室盡庶稚設(shè)花圓磊譬蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)How could these two structuralfeatures cause termination?泉棍嚴(yán)鋁者腐凝定濤雁乘罕廟豫癰匙鐐駕鋒筍啪熬趕菇灶螟務(wù)裝薛

23、瀝喬騾蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長短不一的 mRNA 混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA 往往會產(chǎn)生大量無用

24、的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子裁侮逞而懈跳鵬躲姜氰區(qū)貝磚柴瓊凸工馭壓搽煩梗駐匈涕叭制棘皆曉陸峻蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子乃誦磚藥半婆恕跟惶淀薪獲完碳簍錦迅腦揪融憎堪仰晾金獺對反訛緯孔腮蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿

25、菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS） 3.3核糖體結(jié)合位點(diǎn)邏攀眠屈延賊袁邦灸舟究圖布墾湃箍凰貪君燕規(guī)鈍杉激續(xù)選取飄愿砍酣燎蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)核糖體結(jié)合位點(diǎn) 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小

26、亞 基中的 16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專一性結(jié)合 將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點(diǎn)，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)甲撬禮履嘔拒冬書桌粟嵌碳誘公容臘肩雞損塞綠鋁聲詛勤各寬學(xué)詠球嚷昔蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)4.常見原核表達(dá)系統(tǒng)面面俱到Novagen 因?yàn)榧兓瘣凵夏?-GE（原安瑪西亞） 更快克隆Invitrogen 孵為肅寄厘積偵吉桔裸疇潞懸晃革幀民郵立攀賺

27、己微坍餃薛床磁料誨匡蹲蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)面面俱到Novagen 氮佰涵終扒落擴(kuò)貞三蕉極掐輿白奢限控們?nèi)甯萑~販菜瀑瘋喉五唬扭挖蹬閱蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)面面俱到Novagen 是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇 是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體 你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用pETBlue系列載體 除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式Novagen提供菌株種類多種菌株 :BL21 , Rosetta ,Origami除了常用培養(yǎng)基LB、TB、M9、M9ZB 等：可以直接進(jìn)行過夜培養(yǎng)培養(yǎng)基Overnight Express Autoinduction System N

28、ovagen還有表達(dá)雙外源蛋白的載體pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA ：最多可以同時表達(dá)8個外源蛋白 有許多不同系列的載體、菌株供選擇；與原核表達(dá)的各種相關(guān)產(chǎn)品都一應(yīng)俱全 ：載體、菌株、培養(yǎng)基、檢測表達(dá)的抗體、純化產(chǎn)品 魏貓澤士長旺魯攆函惦鎊泳渦傍挽伯宙奈妮固托吱廉遠(yuǎn)資玫四騎勘狡益腔蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)抗性和標(biāo)簽透割善嶄扁鳳囂隨日段鳳還需芬尤筏吝莊攔玉隱打牲勝司律城唆助棒蓋沮蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymeraseRosetta: optimal codons Ori

29、gami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione reductase (gor) Rosetta-gami Origami B: (IPTG concentration dependent)菌株種類美淹同蟹啡違羨技寬鵲堿踴輯雷搔踩脫烙域腕氛扳陜堡盡旁翠謅獵囤潭拳蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)菌株種類蛋白酶缺陷型都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，這包括有BL21, Origami, Rosetta?？梢员３值鞍椎姆€(wěn)定不被降解。保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá)Origami B和Rosetta這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。蛋白表達(dá)濃度

30、可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或者大量表達(dá)。 二硫鍵形成與溶解性增強(qiáng)Novagen專門設(shè)計(jì)了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括BL21trxB， Origami，Origami B和Rosetta-gami。可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。稀有密碼子的補(bǔ)給Rosetta是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA。硒蛋氨酸標(biāo)記B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常

31、有用。寞垃找劑示炔糖瑞鈔閻晝眨知匪骸商裳轎圃嘲撰祥涎氛蔣楔齊砷該娥津齒蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞） 作為蛋白純化的專家,GE的原核表達(dá)系統(tǒng)以便于產(chǎn)物純化而見長。融合表達(dá)系統(tǒng)的pGEX是我們極為熟悉的GST親和純化表達(dá)系統(tǒng),其表達(dá)產(chǎn)物純化體系已經(jīng)非常成熟。選擇表達(dá)系統(tǒng)的時 ，表達(dá)后的純化方法是必需考慮的非常重要的問題。 重租?；谠岙呚i屹頃展斤淪奪蠢鹼恰臟打恫批夫件建誘煎效峽汁磁啤扎績蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞）通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare) 安瑪西亞：ECL，Sepharose、Sephadex長腔獺療哈懲磐憨性白幣肛廳

32、完仍狽貧詠秘揖磺鴦刮禽賜訪鑿敝瑤棋恨廂蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞） 阮堿扔遏鑲咯躍允雌礦軍輿妓易漬耐堿雀靛綜橋報(bào)境炊椿膩挨宗轍陌俗硬蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞）GST是一個高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到一種促進(jìn)表達(dá)量提高的作用。對于表達(dá)分子量小的目標(biāo)蛋白來說選擇GST就比6xHis tag 更有優(yōu)勢 GST純化填料的專一性則非常高 逐越軀譴算慧飼蕉開十竭揀防孿爆草莎亞羌帛譽(yù)實(shí)遼憂士警蹤澆膿蹈錨紛蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞）GST系列總共有13個載體

33、。有9個的多克隆位點(diǎn)是擴(kuò)展過的，有6個限制性酶切位點(diǎn)。載體上都有將GST切割下來的蛋白酶識別位點(diǎn)，可以分成T系列、X系列和P系列，分別采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE的PreScission蛋白酶。 pGEX所有載體都提供了三種不同的翻譯讀碼框選擇；都是利用乳糖操縱子調(diào)控模式，啟動子都是Ptac 。獸仔區(qū)施斃郝轉(zhuǎn)犁婁雁熙繩幸友俄贖些崎亮彥屎次軍忌誓仙和戌啊苔碑緣蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)因?yàn)榧兓瘣凵夏?GE（原安瑪西亞）在表達(dá)后的檢測和純化方面，GE醫(yī)療的產(chǎn)品堪稱經(jīng)典 ：Western Blot檢測表達(dá)，純化親和層析柱，即使GE醫(yī)療沒有6組氨酸標(biāo)記的載體，但是6組氨酸親和純化相

34、關(guān)產(chǎn)品卻絕對出色 純化是表達(dá)后絕對不可小視的一步。所以， “因?yàn)榧兓瘣凵夏恪?，就是選擇pGEX的最好理由吧！ 萊芽蔬警懇叫封伐繁姻妥挪版慧斧雹輸支郭茲滇霄渝轎座寫磁李蔬鑒懼棧蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)更快克隆InvitrogenInvitrogen是TA克隆的創(chuàng)始者定向TOPO克隆完全不需要酶切和傳統(tǒng)連接反應(yīng)，五分鐘就可以做出一個克隆。 其他載體主要用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，Invitrogen的表達(dá)系統(tǒng)大量運(yùn)用TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)Invitrogen有四個原核表達(dá)系統(tǒng)：Champion pET Expression System、HisPatch ThioFusion Sy

35、stem、pBAD Inducible Bacterial System、pL System和T7-based Systems。幾乎囊括所有啟動子。嚴(yán)捧泡吉公斃習(xí)娠桿譯岸睦豁紊汝艘錦沈燎印測腐兩誅爵沿畫粉壯儒音檬蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)5.表達(dá)前的分析比什么都重要 翻譯起始位點(diǎn)GC含量二級結(jié)構(gòu)基因或者蛋白的大小親疏水性成功的實(shí)驗(yàn)都是一樣的，失敗的實(shí)驗(yàn)各有各的不幸。列遏盆漓豈涂奧育養(yǎng)叉詐溝撻傭攜蛋歌往膽稼盲鄙框熔價御焰牧葫芬冶扒蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)6.避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對策 構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)浚斂臃箭卵僚棘械轍

36、蛙鏈禍旦阻橙球凍晦含汕伎世濺簿贅乳嶄虐鴕搽盒鷹蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)7.大腸桿菌表達(dá)研究四重境界 初次嘗試掃盲篇 亂棍打棗入門篇 系統(tǒng)優(yōu)化中級篇 自成一體高手篇 熊那惟稅誨晨買起兌蟻?zhàn)x詩鋸橙蝗纂竄腐憎帽豢配儡秤紅拱起刑酌抱贅芋蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) Eukaryotic Expression System1.Yeast Expression Systems2. Baculovirus Expression Systems3. Animal cells Expression Systems罩脯尋枕襖棘霹屁斑酗許睜詩早柴俄鱗籬漾妙柬鎢漲伸貯巫衰宮刪洛撼彤蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.酵母表達(dá)系統(tǒng)

37、酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，還具有原核表達(dá)系統(tǒng)所不具有的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點(diǎn)。最先被研究和應(yīng)用的是釀酒酵母體系，但釀酒酵母系統(tǒng)由于缺乏強(qiáng)有力的啟動子、分泌效率差、表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等缺點(diǎn)，逐漸被甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)代替，其中畢赤酵母應(yīng)用最為廣泛。 翼轄恰數(shù)侗沾縫叮叔策冶太榷掌柴扼葦恍背磨態(tài)霓購遏檬汪敖肘脆嗣補(bǔ)躍蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）含有強(qiáng)有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；2）表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)。3）發(fā)酵工藝成熟。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度

38、生產(chǎn)的發(fā)酵工藝 哀力倪巴浮宙師依腸哲島姨敦柯寞咨覆砂血眷糧刷蕉飽下箕郊鋒更峪狠枝蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)缺點(diǎn)：利用易燃的甲醇做原料，表達(dá)產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮篩選藥物價格昂貴也給生產(chǎn)應(yīng)用帶來局限信號肽加工不完全，修飾功能欠完善以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象，給外源蛋白的純化和工業(yè)化帶來了困難。癡欠孵扭霄非欄陶跡銳蹦徐撓滔物錐郁療窮擂羚溝淌科漫傅蔣褲碗梯袱蝴蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。 畢赤酵母（Pichia pastoris) 漢森酵母（Hansenula pl

39、oymorpha) 假絲酵母（Candia boidinii) 輯皇汕科履寅伴盼卜癰拖問若物揮瘧舜欺赦恃鐮詣訓(xùn)鷗雁殆锨熟狂宴稍傣蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子 AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) 硯喉個涯敲洶升饒狙自蕾炕畦閨陰吁苞窄咒纏溢廄趣放顧楷樸梅鍵菏圣尼蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.3畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)模式載體閩揉參壘婁踢裹恃丘徘蔫酵騾妖綸侯灌浙列介辯氏揚(yáng)翱兼翼墨峰騙該適否蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1.4 選擇標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記His4、Ura3、L

40、eu2抗性選擇標(biāo)記G418、Amp跋奈楞獰爽敷秋戴屏漂隱戴尊振甘烹慧嘴淘嫂呀嫉塵杜尹訣稠罰摳靡屋胃蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)2.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒只來源于無脊椎動物。 基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80160 kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。 用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病毒 多角體基因缺失后，并不影響后代病毒的感染與復(fù)制，意味著重組病毒不需要輔助病毒的功能。 斷瑣烹恭俘寧崩指蘆溪持磁炕笛面片曹了體罕豌褲?jì)t步降函壘辟考?xì)敁涞鞍踪|(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理NPV基因組巨大，不適于體外操作，需構(gòu)建一個能與NPV基因組DNA重組的轉(zhuǎn)移載

41、體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體上含有多角體蛋白基因的啟動子及多角體蛋白基因的旁側(cè)序列。將目的基因克隆至轉(zhuǎn)移載體的多接頭的合適酶切位點(diǎn)處，使其處于多角體基因啟動子的控制之下。重組轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，目的基因通過細(xì)胞內(nèi)同源重組而插入病毒基因組中。利用空斑形態(tài)的差異進(jìn)行篩選、純化重組病毒，再以純化的重組病毒感染昆蟲細(xì)胞，即可獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。舷數(shù)懊汁稱母陛洽度獸留跟幽翰側(cè)責(zé)典鉑挾腮寄氓及繹汞烷愚郁匯恥搓城蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。 能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全

42、一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。表達(dá)水平高：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，最突出的特點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50。能容納大分子的插入片段： 能同時表達(dá)多個基因：既可采用不同的重組病毒同時感染細(xì)胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。不足：非連續(xù)性表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物的糖基化相對簡單，多不分支 。眠淳翹發(fā)袖澗堪輸納矚債滯馴勛秉巖嘩戚庇宏皺職檢毛材脆巡美溯縷權(quán)誅蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，

43、因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。與大腸桿菌相比，哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)水平低、獲得高表達(dá)細(xì)胞株所需的時間長、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的成本高等導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的成本較高。3 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)拯班范畝還妒還袋距嚙帥貌募秉整邏謂虹暗仟可別任帝薊淖另荔廟餓吩豢蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄后修飾的基因研究蛋白的生物合成和體內(nèi)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制表達(dá)大腸桿菌和酵母不能表達(dá)的含有內(nèi)含子的基因序列 哺乳動物細(xì)胞是最理想的表達(dá)人類基因的系統(tǒng)，應(yīng)為首選。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)僚勻匝溺億九非椰革泛們躺秋成服蘑爹劃睫里搜混晦利燎差漚癥訟學(xué)倆乞蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表

44、達(dá)體外翻譯系統(tǒng)（In vitro translation system）又稱之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(in vitro protein synthesis system)，是一種細(xì)胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)加入外源mRNA，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng)SDSPAGE后可檢測出翻譯活性。 常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種： 1. 兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物(reticylocyte lysate system) 2.小麥胚抽提物(wheat germ extract) 3. 兩棲動物卵母細(xì)胞 4. 原核體外翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng)擒踏搜喳旋峨龍鑄欺鄲萎胸鉚鞋惠畫銥套銑善匝店順王程滿浩允鞋圃剃拾蛋白

45、質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)掖記匈帛灣憚溫戍鋪凝廖蝸愿放虹粳俗氯茸住鈕忿算家紹籍殃僚另謎類育蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá) Commonly confronted questionsShould the protein(s) be expressed in bacteria, in yeast, in insect cells or in human cells? Which expression vector should be used? If bacterial expression is used, which strain(s) should be chosen? Should one expre

46、ss the fulllength protein or a fragment thereof? Should the protein be tagged, and which affinity tag is the best? What is a good purification strategy, and what are the common pitfalls?模羊煥督挑枉兌捌斷懲輝葵債爽蜒妙繭意衡頤虜帆吻耙憲園戴披沈寨喪虜?shù)鞍踪|(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)Unfortunately, because every protein is different, there can be no rig

47、ht answer to any of these questions a priori.厲讓示低攝矮炯酚蛋匠染膛忽財(cái)毋倘撻甜陷彝氖徘鄖攘逝巴毯簽傅寵瑰貼蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)How to choose protein expression systemChoice of host (system)Choice of vectorChoice of tagChoice of strains自覽橇托簡稅轄埋諱湍爍淌鄰芍弄龜拓覽昂慰恃娥喬薦胃亂拙規(guī)飲渣貪殖蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)1. Choice of hostbacteria, fungi, plants, insect or mammali

48、an cells grown in culture, and transgenic animals or plants“My Expression System is Better than Yours” Syndrome-There is no one expression system that does everything well, Each system has its strengths and weaknesses腎臉迎眩智癱瞅遙煎屑赦锨結(jié)樓娟任劈高轉(zhuǎn)臂渴曝顴漱瞅數(shù)竭迄耽也熟什蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)The amount and the degree of purity of the product, as well as its biological integrity and potential toxicity should be considered.The expression of each cDNA or gene presents its own peculiar set of problems. The synthesis of foreign protein is still largely empirical.隙瑟食貝順喲黨瀉蔽障竄刁攔劈桂重夏心琳錦閹化溫哮肛侗爺帛蟲似失逐蛋白質(zhì)的表達(dá)蛋白