分子發(fā)光分析分解課件

1、第三章 分子發(fā)光分析 分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。本章主要討論熒光分析。3.1 分子熒光和磷光分析一、原理熒光和磷光的產(chǎn)生 室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動(dòng)能層。處于基態(tài)的分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等)后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“發(fā)光”。下面從分子結(jié)構(gòu)理論來(lái)討論熒光和磷光的產(chǎn)生機(jī)理。續(xù)每個(gè)分子具有一系列嚴(yán)格分立的能級(jí)、稱(chēng)為電子能級(jí)，而每個(gè)電子能級(jí)中又包含一系列的振動(dòng)能層和轉(zhuǎn)動(dòng)能層。示意于右圖。圖中基態(tài)用S0表示，第一電子激發(fā)單重態(tài)和第二電子激發(fā)單重態(tài)分別用S1、S2表示，第一電子激發(fā)

2、三重態(tài)和第二電子激發(fā)三重態(tài)分別用T1，T2表示。0、1、2、3表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能層。 S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l 2l 1l 3 外轉(zhuǎn)換l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫熒光：10-710 -9 s；磷光：10-4 100 s續(xù) 電子激發(fā)態(tài)的多重度用M=2S+1 表示, S 為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和。其數(shù)值為0或1。根據(jù)Pauli不相容原理，分子中同一軌道所占據(jù)的兩個(gè)電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對(duì)。假如分子中全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的。即 S=0，分子的多重度 M=1，該分子體系便處于單重態(tài)，用符號(hào)S表示。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是處于單重態(tài)的。分子

3、吸收能量后，若電子在躍遷過(guò)程中不發(fā)生自旋方向的變化，這時(shí)分于處于激發(fā)的單重態(tài)，如上圖中的 Sl 和 S2。如果電子在躍遷過(guò)程中還伴隨著自旋方向的改變，這時(shí)分子使具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，即 S=1，分子的多重度M=3，分子處于激發(fā)的三重態(tài), 用符號(hào)T表示。處于分立軌道上的非成對(duì)電子，平行自旋要比成對(duì)自旋更穩(wěn)定些(洪特規(guī)則)，因此三重態(tài)能級(jí)總是比相應(yīng)的單重態(tài)能級(jí)略低，如上圖中的T1和T2。 處在激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過(guò)程返回基態(tài)，其中以速度最快，激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。有以下幾種基本的去活化過(guò)程。激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回

4、基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10 -710 -9 s, 第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；磷光：10 -410 s； 第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài).非輻射能量傳遞過(guò)程振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。內(nèi)轉(zhuǎn)換： 同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換。通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。外轉(zhuǎn)換： 激發(fā)分子與

5、溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過(guò)程電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（T1 S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（ S0 T1禁阻躍遷）。S0 激發(fā)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫 T1。發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。熒光發(fā)射電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（ 多為 S1 S0 躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為 2 的熒光； 10-710-9 s 。發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；

6、 2 2 1 ；磷光發(fā)射二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1. 激發(fā)光譜熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長(zhǎng)，這可從它們的激發(fā)光譜曲線來(lái)確定。繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，選擇熒光(磷光)的最大發(fā)射波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)。改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化。以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即得到熒光(磷光)化合物的激發(fā)光譜。 任何熒光（磷光）化合物都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。他們是定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。2. 發(fā)射光譜簡(jiǎn)稱(chēng)熒(磷)光光譜。如果將激發(fā)光波長(zhǎng)固定在最大激發(fā)波長(zhǎng)處，然后掃描發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同發(fā)射波長(zhǎng)處的熒(磷)光強(qiáng)度，即得到熒(磷)光發(fā)射光譜。下圖為萘的激發(fā)光譜

7、、熒光發(fā)射光譜和磷光發(fā)射光譜。 stokes 位移。在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對(duì)于吸收位移到較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，稱(chēng)為Stokes位移。這是由于受激分子通過(guò)振動(dòng)弛豫而失去振動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失。因此在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。 3. 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系(1) Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。(2) 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2, 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如2)

8、。 (3) 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似. 基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜三、溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度1. 熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系發(fā)射的熒光光強(qiáng) If 正比于該系統(tǒng)吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)，即根據(jù)比爾定律：If = I a式中是摩爾吸光系數(shù)，l是樣品池的光程，c是樣品濃度。而式中I a = I0 It= I0 (1-10

9、-lc)If = I0 (1-10-lc) = I0 (1-e-2.3lc)式中I0 是入射光強(qiáng)度，It 是透過(guò)光強(qiáng)度。將此式代入上式得當(dāng)lc0.05 時(shí)，可省略第二項(xiàng)后的各項(xiàng)，則續(xù)當(dāng)入射光強(qiáng)與I0與l一定，上式可簡(jiǎn)寫(xiě)為If = 2.3I0lc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液的溶液中，當(dāng)lc0.05 時(shí)才成立。對(duì)于較濃的溶液，由于淬滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系。If = Kc四、影響熒光強(qiáng)度的因素1.熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：（1）分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光；（2）吸收了與其本身特征頻

10、率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率 () 也稱(chēng)熒光效率或量子效率, 它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示. 分子結(jié)構(gòu)影響熒光強(qiáng)度(a) 躍遷類(lèi)型(b) 共軛效應(yīng)(c) 剛性平面結(jié)構(gòu)(d) 取代基效應(yīng)續(xù)(a) 躍遷類(lèi)型 實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由* 或n* 躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生*或*n躍遷而產(chǎn)生熒光，其中*躍遷的量子效率較高。(b) 共軛效應(yīng) 含有*躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)。這種體系中的電子共軛度越大，電子非定域性越大，越易被激發(fā)，熒光也就越易發(fā)生，而且熒光光譜將向長(zhǎng)波移動(dòng)。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)；除少

11、數(shù)高共軛體系外，能發(fā)生熒光的脂肪族和脂環(huán)族化合物極少。任何有利于提高電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，并使熒光波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。續(xù)(c) 剛性平面結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子具有強(qiáng)烈的熒光因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減小，也就減少了碰撞去活的可能性。 比較熒光素和酚酞的結(jié)構(gòu)。熒光素在溶液中有很強(qiáng)的熒光，而酚酞卻沒(méi)有。這主要是熒光素分子中的氧橋使其具有剛性平面結(jié)構(gòu)。又如芴和聯(lián)苯在同樣條件下其量子效率分別為1利0.18，芴中的亞甲基使分子的剛性增加，導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上顯著的差別。續(xù)(d) 取代基效應(yīng) 芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對(duì)該化

12、合的的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大的影響。一般說(shuō)來(lái)，給電子基團(tuán)，如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)楫a(chǎn)生了p - 共扼作用, 增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。而吸電子基團(tuán)，如-COOH、-C=O、 -NO2、-NO、鹵素離子等，會(huì)減弱甚至?xí)銣鐭晒?。如硝基苯為非熒光物質(zhì), 而苯酚、苯胺的熒光較苯強(qiáng)。 2.溶劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)：指的是溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響。有的情況下，增大溶劑的極性，熒光增強(qiáng)，熒光峰紅移。8-巰基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四種不同的極性溶劑中的情況就是一例（見(jiàn)下表）。續(xù)8-巰基喹啉的熒

13、光峰的位置和熒光效率與溶劑介電常數(shù)的關(guān)系但也有相反的情況。例如苯氨萘磺酸類(lèi)化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五種醇中，隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減小，熒光峰藍(lán)移。因此，熒光光譜的位置和強(qiáng)度與溶劑極性之間的關(guān)系，要看各種物質(zhì)與溶劑的不同而異。例：芘的熒光發(fā)射光譜激發(fā)波長(zhǎng)334nm。芘的熒光發(fā)射光譜依次在373 nm、379 nm、384 nm、390 nm 和410 nm 附近出現(xiàn)五重發(fā)射峰。其中, 第一發(fā)射峰與第三發(fā)射峰強(qiáng)度比(I1/I3 )會(huì)隨著溶液極性的減小而下降。因此, I1/I3常用來(lái)表征其所處環(huán)境極性的大小, 其值越大表明芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越大; 反之, 若I1/I3越小則表明

14、芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越小。芘在水溶液中的熒光譜 (b)在甜菜堿溶液中的熒光譜3. 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較敏感，因此熒光分析時(shí)一定要控制好溫度。溫度上升使熒光強(qiáng)度下降。主要的原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時(shí)，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動(dòng)能量，隨后迅速振動(dòng)弛豫而喪失振動(dòng)能量。另一個(gè)原因是溶液溫度下降時(shí)，介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與溶劑分子碰撞也隨之減少。相反，隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。4. 溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的pH有關(guān)。因此在熒光分析中要嚴(yán)格控制溶液的pH值。 例

15、Chunxue Yuan, Shohei Saito,Cristopher Camacho, Stephan Irle, Ichiro Hisaki, and Shigehiro Yamaguchi. A -Conjugated System with Flexibility and Rigidity That Shows Environment-Dependent RGB Luminescence. Journal of the American Chemical Society. 2013, 135, 88428845(Received: April 27, 2013. Published

16、: May 30, 2013)Anthraceneimide蒽酰亞胺+cyclooctatetraene環(huán)辛四烯Conformational change of with flexible and rigid scaffolds, which perturbs the -conjugation.續(xù)環(huán)境的影響(a) RGB(red, green and blue) emissions of 1 in PMMA(聚甲基丙烯酸酯) matrix (blue), in CH2Cl2 solution (green), and in the crystalline state (red). Photog

17、raphs under a 365 nm ultraviolet lamp irradiation. (b) The corresponding three luminescence spectra of 1 in the visible region. ex = 350, 350, and 450 nm for blue, green, and red emission spectra, respectively. The same red emission band was observed even when ex = 350 nm.(a) Temperature-dependent f

18、luorescence spectra of 1 in MTHF(2-甲基四氫呋喃) from 163 K (solution) to 77 K (glass). ex = 350 nm. (b) Calculated potential energy diagram for the S0 and S1 states of 1 (see Figure 1) with fixed bent angle . The constrained geometry optimization was performed in the S1 state at the PBE0/def-SV(P) level.

19、溫度的影響五、溶液熒光的淬滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱(chēng)為熒光淬滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱(chēng)為淬滅劑。熒光淬滅的形式很多，機(jī)理也較復(fù)雜。Q 淬滅劑3.2 熒光分析儀一、基本結(jié)構(gòu)熒光分析儀基本部件示意圖 續(xù)(1) 激發(fā)光源 在紫外可見(jiàn)區(qū)范圍，常用的光源是氙燈和高壓汞燈。(2) 樣 品 池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。(3) 單 色 器 較精密的熒光分光光度計(jì)均采用光柵，有兩個(gè)：第一單色器用于選擇激發(fā)波長(zhǎng)；第二單色器用于分離出熒光發(fā)射波長(zhǎng)。(4) 檢 測(cè) 器 熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測(cè)器具有較高的靈敏

20、度或光電倍增管作檢測(cè)器，并與激發(fā)光成直角。二、熒光分光光度計(jì) RF-5301PC型適合高靈敏度、高分辨率測(cè)定。提供的數(shù)據(jù)處理、顯示功能。測(cè)定范圍 220750nm及白色光帶寬 1.5，3，5，10，15，20nm靈敏度 S/N比150以上（帶寬5nm、水拉曼峰時(shí)）測(cè)定方式 熒光、激勵(lì)、同期光譜測(cè)定、定量測(cè)定、時(shí)間過(guò)程測(cè)定日立F-4500儀器光路圖四.可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖3.3 分子熒光分析法及其應(yīng)用1. 定量測(cè)定方法 由于自身發(fā)射熒光的化合物為數(shù)不多，因此往往利用有機(jī)試劑與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成發(fā)熒光的配合物來(lái)進(jìn)行測(cè)定

21、。很多無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的測(cè)定都用此法。（i) 校準(zhǔn)曲線法 熒光分析一般多采用校準(zhǔn)曲線法，即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)和試樣一樣的處理后，配成一系列標(biāo)淮溶液，在一定的儀器條件下測(cè)定這些溶液的熒光強(qiáng)度，作出校準(zhǔn)曲線。然后在同樣的儀器條件下，測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，從校準(zhǔn)曲線上查出它們的濃度。(ii) 比 較 法 如果已知某測(cè)定物質(zhì)的熒光校準(zhǔn)曲線的濃度線性范圍，取已知量的熒光物質(zhì)(此量在校準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi))配成一標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。然后在同樣條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，由準(zhǔn)溶液的濃度和兩個(gè)溶液的熒光強(qiáng)度的比值，求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。實(shí)例: 稀土離子絡(luò)合物熒光探針測(cè)量膽紅素及其熒光猝滅機(jī)理研究邊

22、瑋瑋,張娜, 閻芳, 王守訓(xùn),李耀輝.分析化學(xué).2010,38 :1501 1504摘要在NH4Ac-HAc 緩沖溶液( pH 6.90) 中，強(qiáng)力霉素可以和銪離子( Eu3+) 生成二元絡(luò)合物，能量從強(qiáng)力霉素轉(zhuǎn)移到Eu3+，發(fā)射出Eu3+ 位于612 nm 處的特征熒光。加入膽紅素后，強(qiáng)力霉素將能量轉(zhuǎn)移給膽紅素。因此，Eu3+ 位于612 nm 處的特征熒光強(qiáng)度降低，且降低的熒光強(qiáng)度與加入膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了熒光光度法測(cè)量膽紅素的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)量的線性范圍為5.0 10 - 8 3.0 10 - 5mol /L; 檢出限為8.4 10- 9mol /L。本方法操作簡(jiǎn)單，

23、可以較好地避免共存物質(zhì)的干擾，并成功用于人血清樣品中膽紅素含量的測(cè)定。測(cè)量原理本實(shí)驗(yàn)選擇強(qiáng)力霉素作為Eu3+ 的配體，所形成的二元絡(luò)合物能夠發(fā)射出Eu3+ 位于612 nm 的特征熒光。實(shí)驗(yàn)表明，加入膽紅素能夠顯著降低Eu3+位于612 nm 處的特征峰，并且熒光強(qiáng)度的降低值與加入的膽紅素的濃度成正比，據(jù)此建立了測(cè)量人血清中膽紅素的熒光分析方法。本方法可以在室溫下操作。應(yīng)用本方法測(cè)量人血清實(shí)際樣品中膽紅素含量，并討論了體系熒光猝滅的機(jī)理。膽紅素強(qiáng)力霉素2 實(shí)驗(yàn)部分2 1 儀器與試劑RF-540 型熒光分光光度計(jì)、UV-265 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)( 日本島津公司) ; PHS-3B 型酸度計(jì)

24、( 上海雷磁儀器廠) 。膽紅素( BR，上海衛(wèi)輝化學(xué)試劑廠) 儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量BR，以石英亞沸蒸餾水溶解，使用前以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液( 1.0 10-5 mol /L) ; 強(qiáng)力霉素( DC，中國(guó)藥品生物制品檢定所) 儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1918 g 強(qiáng)力霉素，以石英亞沸蒸餾水溶解并定容至500 mL，得6.0 10-3 mol /L 的儲(chǔ)備液，使用時(shí)以石英亞沸蒸餾水稀釋得工作液( 6.0 10-4mol /L) ; Eu3+ 儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量Eu2O3( 99. 99%，上海躍龍有色金屬有限公司) ，加入少量濃HCl，加熱使其溶解，并揮發(fā)至近干，然后用0 1 mol /

25、L HCl 稀釋至100 mL，作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)以石英亞沸蒸餾水逐級(jí)稀釋至5. 0 10 -4mol /L; 0.10 mol /L NH4Ac-HAc( pH 6. 90) 緩沖溶液。以上儲(chǔ)備液與工作液均需置于0 4 的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存。2. 2 實(shí)驗(yàn)方法2. 2. 1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在10 mL 比色管中依次加入2 0 mL 0 10 mol /L NH4Ac-HAc 緩沖液( pH 6. 90) 、1. 0 mL 5. 0 10-4 mol /L Eu3+ 溶液、0.5 mL 6.0 10-5 mol /L DC(強(qiáng)力霉素) 溶液和2.0 mL 1. 0 10-5 mol /L BR

26、溶液，以石英亞沸蒸餾水定容至刻度，在室溫放置20 min 后測(cè)量吸收光譜和熒光光譜。在ex /em =385 /612 nm 處，測(cè)定其熒光強(qiáng)度F，同時(shí)測(cè)定其試劑空白( 緩沖液-DC-Eu3+) 的熒光強(qiáng)度F0，加入BR 后使Eu3+-DC 體系熒光強(qiáng)度的減小值表示為F = F0 - F。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行人血清中痕量膽紅素的含量測(cè)定。2.2.2 人血清樣品的處理方法 按文獻(xiàn)3對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理: 取血清1.0 mL，加入乙腈2 mL，攪拌，以4000 r /min 離心20 min，取上層清液至分液漏斗中，加入氯仿4 mL，用HCl 調(diào)至pH 1 2，振蕩，靜置，取下層溶液于另一分液漏斗中，用

27、NaOH 調(diào)至pH 12 13，振蕩，靜置，取上層清液，加0.1 mol /L NH4Ac-HAc 緩沖溶液( pH 6.90) 2 mL，用HCl 調(diào)至pH 6 7，定容至10.0 mL，待測(cè)。3 結(jié)果與討論3.1 熒光光譜和吸收光譜DC-Eu3+ 以及加入不同體積BR 的DC-Eu3+-BR 體系的熒光光譜見(jiàn)圖1。由圖1 可見(jiàn)， DC-Eu3+ ( 曲線1) 在590和612 nm 出現(xiàn)兩個(gè)Eu3+的特征峰，分別對(duì)應(yīng)于Eu3+ 的5D07F1和5D07F2躍遷，這表明能量從配體DC 有效地轉(zhuǎn)移到了Eu3+。DC-Eu3+-BR 的熒光光譜( 曲線2 4) 和DC-Eu3+的熒光光譜形狀相似

28、，但在DC-Eu3+-BR 體系中，加入不同量的BR，Eu3+在612 nm 的特征熒光強(qiáng)度發(fā)生規(guī)律性降低。圖1 DC-Eu3+ 體系以及加入不同體積BR 的DC-Eu3+ -BR 體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different mixture1. Doxycycline(DC)-Eu3+; 2. Eu3+-DC-Bilirubin(BR) ( BR: 0.5 mL ) ; 3. Eu3+-DC-BR ( BR:1.0 mL) ; 4. Eu3+-DC-BR (BR: 1.5 mL)3.2 酸度的影響 酸度對(duì)體系的熒光強(qiáng)度有很大的影響(見(jiàn)圖3)。由

29、圖3可見(jiàn)，在pH 6.0 8.0 之間，體系的F 先增大后降低。當(dāng)pH = 6.8 7.0 時(shí)，體系的F 值達(dá)到最大且基本保持不變，故本研究選擇pH 6.90 的0.1 mol /L NH4Ac-HAc 為緩沖體系。同時(shí)考察了緩沖溶液用量的影響，當(dāng)緩沖溶液加入量在1.5 2.5 mL 時(shí)，F(xiàn) 基本保持穩(wěn)定且熒光強(qiáng)度最大，故本研究中緩沖溶液加入量選擇為2. 0 mL。3. 3 Eu3+ 濃度與強(qiáng)力霉素濃度比值的影響3.6 線性范圍和檢出限3.7 血清中BR 的測(cè)定3. 4 反應(yīng)時(shí)間和加入順序的影響3.5 共存物質(zhì)的影響在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了人體中常見(jiàn)的金屬離子和氨基酸類(lèi)等共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)2 0

30、10 - 5mol /L膽紅素的影響。在相對(duì)誤差在 5%范圍內(nèi)時(shí)，Cu2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Zn2+、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、L-組氨酸、L-胱氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、蛋氨酸等物質(zhì)不影響測(cè)定。測(cè)定結(jié)果熒光分析法的特點(diǎn)靈敏度高 與紫外可見(jiàn)分光光度法比較，熒光是從人射光的直角方向檢測(cè)，即在黑背景下檢測(cè)熒光的發(fā)射。所以一般來(lái)說(shuō)，熒光分析的靈敏度要比紫外可見(jiàn)分光光度法高24個(gè)數(shù)量級(jí)，它的測(cè)定下限在0.10.001ug.cm-3之間。 選擇性強(qiáng) 熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射，又能依據(jù)特征吸收來(lái)鑒定物質(zhì)。假如某幾個(gè)物質(zhì)的發(fā)射光譜相似，可以從激發(fā)光譜的差異把它們區(qū)分開(kāi)來(lái)；而如果它們的吸收光譜相同，則可用發(fā)射光譜將其區(qū)分。 試樣量少和方法簡(jiǎn)便。 提供比較多的物理參數(shù) 熒光分析法能提供包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、熒光效率、熒光壽命等許多物理參數(shù)。這些參數(shù)反映了分子的各種特性，能從不同角度提供被研究的分子的信息。某些有機(jī)物的熒光測(cè)定氨基酸和他們的熒光特性 氨基酸方法激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)靈敏度(ug/mL)色氨酸直接測(cè)定pH112873480.003酪氨酸直接測(cè)定pH72803100.01苯丙氨酸直接測(cè)定H2O260282