細(xì)胞增殖與調(diào)控課件

1、第二節(jié) 細(xì)胞周期調(diào)控一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用 MPF（卵細(xì)胞促成熟因子，matuation-promoting factor；細(xì)胞促分裂因子，mitosis-promoting factor；M期促進(jìn)因子，M-phase-promoting factor）。 Johnson和 Rao(1970)將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞混合，在滅活仙臺病毒介導(dǎo)下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome，PCC)。 G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制；S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始

2、復(fù)制；G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。注射實驗表明：孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟；成熟卵細(xì)胞質(zhì)中，含有卵母細(xì)胞成熟的因子，稱做MPF人M期細(xì)胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC：提示M期細(xì)胞存在誘導(dǎo)PCC的因子；不同形態(tài)的PCC 不僅同類M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，如人和蟾蜍的細(xì)胞融合時同樣有這種效果，這就意味著M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)。 早在1960s，Yoshio Masui發(fā)現(xiàn)成熟蛙卵的提取物能促進(jìn)未成熟卵的胚胞破裂(Germina

3、l Vesicle Breakdown，GVBD)，后來Sunkara將不同時期Hela細(xì)胞的提取液注射到蛙卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)G1和S期的抽取物不能誘導(dǎo)GVBD，而G2和M期的則具有促進(jìn)胚胞破裂的功能，它將這種誘導(dǎo)物質(zhì)稱為有絲分裂因子(MF)。后來在CHO細(xì)胞，酵母和粘菌中也提取出相同性質(zhì)的MF。這類物質(zhì)被統(tǒng)稱為MPF。 1988年Maller實驗室從非洲爪蟾卵中純化出MPF，證明主要含p32和p45兩種蛋白，表現(xiàn)出激酶活性。二、P34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系 1960s L. Hartwell以芽殖酵母為實驗材料，利用阻斷在不同細(xì)胞周期階段的溫度敏感突變株（在適宜的溫度下和野生型一

4、樣），分離出了幾十個與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene，CDC)，如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點發(fā)揮重要的功能。Hartwell還通過研究酵母菌細(xì)胞對放射線的感受性，提出了checkpoint（細(xì)胞周期檢驗點）的概念，意指當(dāng)DNA受到損傷時，細(xì)胞周期會停下來。 以P.Nurse為代表的另一批酵母生物學(xué)家研究不同溫度下培養(yǎng)的裂殖酵母細(xì)胞，也分離出數(shù)十種溫度敏感的突變體。這些不同的突變體在限定溫度下，會滯留在細(xì)胞周期的某個階段。這些與細(xì)胞分裂和周期調(diào)控有關(guān)的基因被稱為cdc(cell division cycle)基因，根據(jù)被發(fā)現(xiàn)的先后順序被命名。

5、 cdc2是第一個被分離出來的cdc基因，表達(dá)34kDa的蛋白，稱p34cdc2。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其具有激酶活性，可以使許多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期調(diào)控中起重要作用。芽殖酵母中的一個關(guān)鍵cdc基因是cdc28，是第二個被分離出來的cdc基因，編碼34kDa的蛋白，具有激酶活性。 p34cdc28是 p34cdc2的同原物，調(diào)控細(xì)胞周期，特別是G2/M期轉(zhuǎn)變。但研究者很快發(fā)現(xiàn)， p34cdc28 或p34cdc2單獨并不具有激酶活性，需要同相關(guān)蛋白結(jié)合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13結(jié)合）。 之后，J.Maller和P.Nurse實驗室立即合作，很快證明爪蟾卵中的p32與p

6、34cdc2是同原物。與此同時，T.Hunt實驗室等以海膽卵為材料研究細(xì)胞周期調(diào)控，發(fā)現(xiàn)一類與細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白，稱為周期蛋白(cyclin)。然后J.Maller和T.Hunt實驗室合作，發(fā)現(xiàn)周期蛋白B，證明與p45和p56cdc13為同原物。2001年10月8日,L.Hartwell、P. Nurse、T.Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。三、周期蛋白 自發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，在不長的時間里有數(shù)十種周期蛋白被克隆和分離。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎動物的A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。各類周期蛋白均含有一

7、段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合，不同的周期蛋白框識別不同的CDK,組成不同的周期蛋白復(fù)合體，表現(xiàn)不同的CDK激酶活性。 M期周期蛋白分子的近N端含有一段9個氨基酸組成的破壞框，參與泛素介導(dǎo)的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能與G1期周期蛋白的更新有關(guān)。周期蛋白分子結(jié)構(gòu)特征 不同周期蛋白的表達(dá)時期不同，與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同CDK激酶的活性。 部分哺乳動物和酵母細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關(guān)系。四、CDK激酶和CDK激酶抑制物 在酵母cdc2和cdc28基因被分離后，幾個實驗室同時工

8、作構(gòu)建了人類、爪蟾和果蠅的cDNA文庫，得到了一系列與cdc2相關(guān)的基因。他們有兩個共同的特點，一是含有一段類似的氨基酸序列，二是都可以同周期蛋白結(jié)合。統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶，CDK激酶。 已經(jīng)命名的CDK激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被發(fā)現(xiàn)，被命名為CDK1。各種CDK分子都含有一段類似的CDK激酶結(jié)構(gòu)域，其中一段PSTAIRE的序列相當(dāng)保守，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。另外，一些位點的磷酸化與激酶的活性有關(guān)。 CDK激酶的效應(yīng)是多方面的，如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失，將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等等。與cdc2類似的CDK蛋白分子圖解 細(xì)胞中還具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激

9、酶抑制因子（CDKinhibitor，CDKI）對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CDKI分為兩大家族： Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4cyclin D1、cdk6cyclin D1復(fù)合物。 CIP/Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip/waf1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip/waf1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成。周期蛋白激酶五、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)運調(diào)控周期蛋白激酶的活性細(xì)胞周期調(diào)控示意圖裂殖酵母細(xì)胞周期的調(diào)控人細(xì)胞周期的調(diào)控（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的調(diào)控作用 CDK1激酶（p34cdc2激酶），由p34cdc2蛋白（或p34cdc28蛋白）與周期蛋白B組成。 CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化絲氨酸和蘇氨酸），參與細(xì)胞的多種功