黃芩指紋圖譜的建立

1、第二章 黃苓指紋圖譜的建立1樣品的收集黃苓主產于河北、山西、內蒙古、遼寧、吉林等地，以栽培品種為主， 只有少量野生品種。本課題從全國八個省區(qū)（山東、內蒙古、甘肅、河北、 安徽、山西、陜西、吉林）共收集到黃苓樣品100批（詳細情況見附錄3）02樣品前處理方法對收集到的各批黃苓樣品，均按照中國藥典 2010年版一部附錄R A項下 藥材取樣法，四分法取樣，1/4留樣，剩余粉碎，分為2060目和過60目篩 的粉末并分別稱重。所有黃苓樣品均裝袋密封，保存于冰柜（-20 C）中，備用。3樣品供試液制備方法46取樣方法按比例稱取2060目和過60目篩黃苓粉末。樣品供試液提取條件的確定臨床上黃苓多用水煎內服的

2、用法，因此確定以水作為提取溶媒。為了防 止提取過程中昔類成分發(fā)生酶解反應，采取了先向樣品中加入沸水，然后再 微沸提取40分鐘，每隔10分鐘振搖一次的提取方法。內標物的確定自山奈酚、柳皮素、葛根素、產丁中篩選黃苓HPLC旨紋圖譜測定內標物， 結果只有葛根素的出峰位置合適，且與黃苓組分色譜峰有較好分離度，所以 選擇葛根素作為內標物。測定結果見圖 1。1.000.80 _0.60- U A 0.40 0.200.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘黃苓樣品0.40A 0.200.00i ! f r b i i i i f f f f i i i10.0020

3、.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘山奈酚柳皮素0.100.050.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘1.000.80.0.20.0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.00分鐘0.60.UA 0.40-70.00葛根素1.00U 0.50 A0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘黃苓加葛根素圖1選擇內標物的HPLC圖譜內標物溶液濃度的確定隨機選取5個黃苓樣品，以制備樣品溶液，并加入等體積不同濃度的內標溶液，混勻，高效液相色譜儀測定，以確定葛根素的濃度，使該濃

4、度下葛根素的峰面積適中。確定葛根素對照品溶液濃度為 100仙g/ml 0內標物溶媒的確定由于向黃苓樣品溶液中加入含甲醇的內標溶液，可能會引起樣品溶液的 醇沉反應，遂作對比試驗：取三份相同的黃苓樣品溶液，標記為I、H、田, 分別加入等體積不同溶媒的內標溶液，搖勻，靜置，觀察樣品是否澄清。結 果見表1。表1內標物溶媒選擇的觀察結果樣品溶液內標液溶媒0h2h12h24hI一澄清澄清澄清澄清n30聊醇澄清澄清渾濁出現(xiàn)沉淀m水澄清澄清澄清澄清根據以上試驗結果，確定以水作為葛根素內標溶液的溶媒樣品供試液的制備自冰柜中取出黃苓粉末樣品，放至室溫。采用四分法，按比例精密稱定2060目和過60目篩的黃苓粉末，共

5、1.5g ,精密加入60ml沸水，稱定重量 后加熱提取40min,每10分鐘振搖一次，取出放至室溫，用蒸儲水補足失重， 離心（轉速2500r/min ） 15min,上精液用0.45小的微孔濾膜濾過，初濾液棄 去，精密量取續(xù)濾液和內標物溶液各0.5ml用于高效液相色譜指紋圖譜測定，其余續(xù)濾液供藥效試驗用。4色譜指紋圖譜測定方法46儀器與試劑Agilent 1200 series高效液相色譜儀； Waters高效液相色譜儀（600四 元梯度泵，996二極管陣列檢測器，Empower6譜工作站）。甲醇、乙月青為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。色譜條件的考察流動相的選擇采用Kromasil

6、C18 （江蘇漢邦科技公司） 色譜柱（150 mm 4.6 mm 5以成 檢測波長280 nm；流速1.0 mL/min ;柱溫30 C；進樣量10 口。分別以甲 醇-0.25%甲酸、乙月青-0.25%冰醋酸、乙月青-0.25%甲酸、乙月青-0.3%磷酸作為 流動相，按表2-1 , 2-2的規(guī)定進行梯度洗脫。結果見圖 2。表2-1流動相選擇試驗表流動相1流動相2時間(30min)0.25%甲酸甲醇時間(30min)0.25%甲酸乙睛0871308515258020307525457030457030556040506040654060556040703070604060753070653070

7、768713668515808713708515表2-2流動相選擇試驗表流動相3流動相4時間(30min)0.25%冰醋酸乙睛時間(30min)0.3%磷酸乙睛08515085153075253075254570304570305060405060405560405560406040606040606530706530706685156685157085157085154.003.00A 2.001.000.00 | 10.0020.0030.0040.00分鐘流動相14.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00流動相23.002.502.00A 1501.

8、000.500.00流動相33.002.502.00A 1.501.000.500.00流動相4圖2流動相的選擇結果表明，乙月青-0.3%磷酸梯度洗脫的分離效果最好測定波長的選擇按4.2.1測定方法在220300 nm波長范圍內，取同一黃苓樣品供試液，每 隔10 nm測定一次。其指紋圖譜結果見圖3。2.502.00A 1501.000.500.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘220 nm10.0020.0030.0040.00 n I 111 I50.0060.0070.00分鐘230 nm2.502.001.501.000.500.00240 n

9、m2.001.501.0010.0020.0030.00A Jk ,40.0050.0060.0070.00分鐘250 nm2.502.00A 1.501.000.500.00分鐘260 nm3.002.502.001.501.000.500.00分鐘270 nm3.002.502.001.501.000.500.00分鐘280 nm3.00 l IL a L1,111 J ,! J bee 10.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘290 nm3.00 2.50 2.00A 1.50 1.00 0.50 0.0010.0020.0030.0040.0050.0

10、060.0070.00分鐘300 nm圖3不同波長下黃苓藥材的指紋圖譜由圖3結果可知，測定波長在280 nm時，色譜圖中各峰間的比例協(xié)調，直觀 效果好，提供的信息量大。因此，選用 280 nm作為指紋圖譜測定波長。柱溫的選擇取同一樣品供試液，按4.2.1和4.2.2的測定方法，在柱溫30 C、35 C、 40 C時分別進行考察，結果見圖4。2.001.50 -1.000.500.00!aamI 1111|r r r|r| a-iii10.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘柱溫：30 C2.00 _1qi|pnh10.0020.0030.0040.0050.00

11、分鐘60.0070 00柱溫：35 C3.00 I 2.00 -A :l|1.00-I TOC o 1-5 h z ihf. jL1 J Rr0.00 -1,1I1 i|i in ! HYPERLINK l bookmark15 o Current Document 10.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘柱溫：40 C圖4不同柱溫下黃苓指紋圖譜結果表明，在不同柱溫下，除保留時間有改變，峰形及分離情況均不受影響。綜合考慮，選擇柱溫為30 C。流速的選擇用同一樣品供試液，以上述測定方法，分別考察流速在0.8 mL/min、1.0mL/min、1.2 mL/min

12、時的分離效果。結果見圖 5。流速：0.8 mL/min2.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘流速：1.0 mL/minA3.002.502.001.501.000.500.00流速：1.2 mL/min圖5不同流速下黃苓指紋圖譜由圖5知，流速在0.8 mL/min時，分離效果不理想，流速 1.0 mL/min時峰 形及分離情況均比較理想。綜合考慮，選擇 1.0mL/min流速。色譜柱的考察選用同一品牌同一型號但批號不同的色譜柱，對同一樣品供試液進行測定。結果如圖6所示。3.00 2.50 2.00A 1.50 1.00 0.50 0.0010.002

13、0.0030.0040.0050.0060.0070.00分鐘圖6同一型號不同批號色譜柱對色譜圖的影響由結果知，采用不同批號的 Kromasil C 18色譜柱(150 mnX 4.6 mm, 5 pm) 測定，色譜圖無明顯差異。不同儀器的考察按相同的色譜分析條件，在Waters600高效液相色譜儀和 Agilent 1200series高效液相色譜儀上分別對同一黃苓樣品供試液指紋圖譜進行測定，結果 如圖7所示。圖7不同儀器對黃苓指紋圖譜的影響結果表明，同一樣品供試液，相同色譜條件，在不同儀器上所測得的色譜圖 并無明顯差異。方法學考察儀器精密度考察取同一樣品供試液，10 nL進樣，、進樣6次，

14、記錄指紋圖譜。以葛根素 峰為內標峰，考察10個共有峰與其相對保留時間及峰面積比值的相對標準偏差（RSD% 見表 3-1、3-2。表3-1黃苓指紋圖譜精密度（相對保留時間）峰號保留時間S1S2S3S4S5S6RSD%112.4492.2182.2172.2162.2262.2192.2210.155214.7452.6282.6262.6252.6362.6302.6290.148328.9575.1765.1705.1735.1615.1575.1410.246433.3595.9655.9585.9655.9455.9385.9190.305534.6416.1946.1866.1946.1

15、756.1666.1440.315636.6096.5486.5406.5496.5256.5156.4910.344739.6257.0907.0817.0907.0607.0487.0230.379850.0428.9828.9718.9818.8928.8678.8450.696958.78910.56710.55410.56510.43510.39910.3780.8431060.58910.89810.88510.89610.74710.70910.6890.920表3-2黃外指紋圖譜精密度（相對峰面積）峰號保留時間S1S2S3S4S5S6RSD%112.4490.4550.4580

16、.4570.4630.4650.4691.197214.7450.3120.3130.3140.3170.3190.3231.344328.95711.81111.88211.87911.62812.02012.1971.616433.3591.2521.2611.2611.2601.2651.2790.695534.6410.2970.3020.3010.3060.3060.3091.460636.6091.2931.3011.3021.3171.3221.3361.210739.6252.8522.8672.8682.8722.8882.9210.838850.0421.8801.8791

17、.8641.8471.8491.8580.778958.7890.4490.4520.4510.4530.4540.4580.6911060.5890.1560.1570.1570.1570.1570.1580.564由結果可知,各共有峰與內標峰的相對保留時間和峰面積比值的相對標準偏差均小于2%表明儀器精密度良好。重復性試驗取同一批黃苓樣品，按供試液的制備方法，重復制備6份供試液，測定其指 紋圖譜。以葛根素峰作為內標峰，考察10個共有峰與其相對保留時間和峰面積比值的相對標準偏差（RSD%結果見表4-1、4-2。表4-1黃外指紋圖譜重復性（相對保留時間）峰號 保留時間S1 S2 S3 S4S5S

18、6 RSD%112.5582.2222.2222.2212.2212.2232.2170.097214.8712.6322.6312.6302.6312.6332.6270.071329.0855.1495.1495.1385.1485.1495.1420.091433.4565.9235.9265.9125.9265.9295.9180.105534.7506.1526.1566.1416.1576.1606.1450.117636.7076.4986.5026.4876.5056.5086.4940.116739.7027.0297.0317.0177.0377.0397.0250.115

19、850.0918.8678.8698.8548.8808.8838.8640.118958.80910.41010.41210.39510.42210.42710.4050.1101060.61210.72910.73010.71410.74310.74710.7240.115表4-2黃外指紋圖譜重復性（相對峰面積）峰號保留時間S1S2S3S4S5S6RSD%112.5580.3680.3690.3700.3710.3710.3690.369214.8710.2460.2470.2470.2500.2490.2480.506329.08510.42210.44410.47710.53110.5

20、2710.4710.417433.4560.7270.7240.7280.7330.7350.7260.578534.7500.2080.2010.2030.2080.2150.2052.275636.7071.3041.3001.3031.3181.3261.3020.806739.7022.4032.4182.4212.4302.4262.4140.397850.0911.2901.3041.3091.3071.2891.2960.666958.8090.2870.2910.2910.2910.2890.2900.6291060.61210.7290.3680.1150.1160.1150

21、.1150.672結果表明，各共有峰與內標峰相對保留時間和峰面積比值的相對標準偏差均 小于3%表明該方法的重復性良好。供試液穩(wěn)定性試驗制備同一樣品供試液，分別在室溫放置 0、2、4、8、12、24 h后進樣，測 定指紋圖譜，結果見表5-1、5-2 o表5-1黃苓指紋圖譜穩(wěn)定性（相對保留時間）峰號保留時間S1S2S3S4S5S6RSD%112.3592.2152.2072.2192.2232.2162.2200.251214.6432.6232.6182.6292.6342.6242.6290.214328.8065.1535.1535.1735.1885.1805.1540.301433.20

22、15.9445.9395.9615.9805.9725.9350.315534.4756.1736.1676.1896.2106.2016.1600.320636.4396.5256.5196.5426.5666.5566.5070.345739.4427.0617.0597.0827.1097.0987.0380.378849.9268.9408.9408.9709.0078.9988.8750.537958.70210.51010.51510.55010.59310.58910.4180.6171060.53010.83810.84510.88010.92610.92310.7310.663表5-2黃岑指紋圖譜穩(wěn)定性（相對峰面積）峰號保留時間S1S2S3S4S5S6RSD%112.3590.4580.4570.4560.4530.4560.4812.27021