轉(zhuǎn)基因技術(shù)及應(yīng)用

1、第十章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因微生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工別離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)Transgene technology。人們常說(shuō)的遺傳工程、基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化均為轉(zhuǎn)基因的同義詞。 第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因植物 p85目的基因和受體的獲得轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因植物的鑒定轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物研究存在的問(wèn)題一、目的基因的來(lái)源采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過(guò)mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CR擴(kuò)增特定基因片段。二、轉(zhuǎn)基因植物受體包括：葉盤、胚軸、莖尖、莖段原

2、生質(zhì)體懸浮細(xì)胞愈傷組織胚狀體活體三、轉(zhuǎn)基因方法直接導(dǎo)入法物理法：基因槍法、電擊法、超聲法、顯微注射法、激光微束法化學(xué)法：PEG法，脂質(zhì)包埋法等載體介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)法花粉管通道法槍擊法將待轉(zhuǎn)化的DNA沉淀在細(xì)小金屬珠的外表，用特制槍將金屬珠直接打入植物細(xì)胞，槍的威力為430 m / s，植物細(xì)胞通常是胚胎細(xì)胞、玉米籽、葉子等，但進(jìn)去的DNA片段整合效率極低。電擊法將高濃度的質(zhì)粒DNA參加到植物細(xì)胞的原生質(zhì)體懸浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的電場(chǎng)中處理假設(shè)干秒鐘，然后將原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 1 - 2 周，再生出整株植物。直接導(dǎo)入法融合法將外源DNA與特殊的

3、疏水性高分子化合物混合，在水中這些疏水性化合物分子形成球狀的脂質(zhì)體，后者與植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合，篩選融合子，再生植物細(xì)胞壁。T-DNA的染色體整合機(jī)制載體介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法p87共整合轉(zhuǎn)化程序二元整合轉(zhuǎn)化程序病毒介導(dǎo)法隨著植物病毒分子生物學(xué)及遺傳學(xué)研究的不斷深入，用病毒基因組作為載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞日益受到人們的重視，因?yàn)椴《据d體能將外源基因?qū)胫参锏乃薪M織和細(xì)胞中，而且不受單子葉或雙子葉的限制。 在大約300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。利用植物病毒載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞大致有以下兩種戰(zhàn)略：轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染植物組織花

4、粉管導(dǎo)入法 將外源DNA沿著花粉管經(jīng)過(guò)珠心進(jìn)入尚未形成正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。這一方法是我國(guó)科學(xué)家周光宇首先提出設(shè)計(jì)的，目前已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究。 花粉管導(dǎo)入法的特點(diǎn)是直接、簡(jiǎn)便。它的受體材料為植株整體，省略了細(xì)胞組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和傳代過(guò)程，排除了植株再生的障礙，特別適合于難以建立有效再生系統(tǒng)的植物。由于轉(zhuǎn)化的是完整植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎細(xì)胞，導(dǎo)入的DNA分子整合效率較高。四、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定選擇培養(yǎng)基檢測(cè)：如Ti質(zhì)粒改造時(shí)插入抗生素標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記檢測(cè)：選擇標(biāo)記治理，如含有-葡糖苷酸酶、熒光素酶基因等目的基因檢測(cè)

5、：PCR、分子雜交等五、轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用植物基因改進(jìn) 抗蟲害植物、抗除草劑植物、高品質(zhì)植物轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物富含維他命A的黃金大米轉(zhuǎn)基因番茄（抗花葉病基因）轉(zhuǎn)基因棉花（Bt基因）抗蟲玉米轉(zhuǎn)基因植物1983 年 美國(guó)和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜。1994 年 世界上第一種耐儲(chǔ)藏的番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市。1995 年 轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國(guó)投入生產(chǎn)。2000 年 美國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過(guò)普通大豆。迄今為止 世界上共批準(zhǔn)了12種作物、6大類性狀的48個(gè)轉(zhuǎn)基因品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜

6、、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴、桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。藥物名稱基因來(lái)源應(yīng)用植物載體核糖體抑制蛋白恬樓、玉米抑制HIV煙草血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶牛奶抗過(guò)敏煙草、番茄抗體老鼠多種用途煙草抗原細(xì)菌、病毒病原口服疫苗煙草、馬鈴薯、番茄腦啡肽人止痛、鎮(zhèn)定劑油菜、擬南芥表皮生長(zhǎng)因子人特殊細(xì)胞增值煙草促紅細(xì)胞生成素人調(diào)節(jié)紅細(xì)胞水平煙草生長(zhǎng)激素鮭魚刺激生長(zhǎng)煙草、擬南芥水蛭素合成血栓抑制劑油菜人血清蛋白人血栓擴(kuò)張劑煙草、馬鈴薯干擾素人抗病毒蕪芩應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因藥物的植物六、轉(zhuǎn)基因植物研究存在的問(wèn)題環(huán)境釋放平安性食品平安性生物平安的含義生物平安使指在一定的時(shí)間與空間范

7、圍內(nèi)，由于自然或人類活動(dòng)引起外來(lái)物種遷移，外來(lái)物種在定居、建群、繁衍、擴(kuò)展的連串過(guò)程中造成對(duì)外鄉(xiāng)物種和生態(tài)系統(tǒng)的威脅、危害，使之衰退，甚至退化和滅絕；或由于人為造成環(huán)境的劇烈變化，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的破壞或掠奪生物資源，砍伐和捕撈過(guò)度，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致物種瀕?；驕缃^；或由于科學(xué)研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用中造成對(duì)人類健康、生存環(huán)境和社會(huì)生活的有害影響。這三種情況均屬于生物平安范圍，第一種其實(shí)是外來(lái)物種入侵，或角生物入侵。第二種情況是生態(tài)環(huán)境的破碎化、片斷化和邊緣化，同樣使生物多樣性受到威脅。第三種情況是指生物技術(shù)和生物工程引起的生物平安問(wèn)題，是科技進(jìn)步帶來(lái)的負(fù)面影響，主要包括轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生物平安問(wèn)題。生物平安

8、問(wèn)題的提出與演化 1973年在美國(guó)新罕布爾州舉行的哥敦會(huì)議上Gordon，在討論核酸問(wèn)題時(shí)，許多生物學(xué)家對(duì)即將到來(lái)的大量基因工程操作的平安性提出擔(dān)憂；1975年2月，在美國(guó)加州阿西羅瑪Asilomar舉行了一次國(guó)際會(huì)議，第一次正式討論轉(zhuǎn)基因生物的平安性問(wèn)題；1976年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NIH發(fā)布?重組DNA分子研究準(zhǔn)那么?，隨后，德、法、日、澳等也相繼制定了有關(guān)重組DNA技術(shù)德平安操作指南或準(zhǔn)那么，經(jīng)濟(jì)開(kāi)展合作組織OECD公布了?生物技術(shù)管理?xiàng)l例?，歐盟公布了?關(guān)于控制使用基因修飾微生物的指令?、?關(guān)于基因修飾生物向環(huán)境釋放的指令?等。1992年6月，聯(lián)合國(guó)環(huán)境與開(kāi)展大會(huì)通過(guò)?生物多樣性公約

9、?，直至2000年1月正式通過(guò)?生物平安議定書?。1993年，國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作與開(kāi)展組織OECD提出轉(zhuǎn)基因食品平安性分析原那么是“實(shí)質(zhì)等同性原那么。即轉(zhuǎn)基因食品及其成分應(yīng)與市場(chǎng)上銷售的對(duì)應(yīng)食品具有實(shí)質(zhì)等同性。這種等同性包括表型性狀、分子特性、主營(yíng)養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子。2001年5月23日，中國(guó)國(guó)務(wù)院第304號(hào)令公布了?農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物平安管理?xiàng)l例?。該條例共分8章，分別是總那么、研究與試驗(yàn)、生產(chǎn)與加工、經(jīng)營(yíng)、進(jìn)口與出口、監(jiān)督檢查、罰那么、附那么等。轉(zhuǎn)基因生物的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn) 轉(zhuǎn)基因生物的“基因污染造成生態(tài)問(wèn)題，引起雜草化。1998年，加拿大Alberta省發(fā)現(xiàn)一種Canola油菜，它由于基因污染而含有抗

10、草甘膦、抗固沙草、抗咪唑啉類除草劑等三掌轉(zhuǎn)基因堆積而成的“光譜抗除草劑基因HT基因。這種多抗性怪異油菜的種子爆莢、休眠期長(zhǎng)、種子很小、圓而光滑，可隨風(fēng)傳播到相當(dāng)遠(yuǎn)的距離，更易造成基因污染和擴(kuò)散，而一般除草劑對(duì)它無(wú)可奈何，成為多抗性的“超級(jí)雜草。另一個(gè)有名的例子是：J. E. Losey 1996年在?Nature?雜志發(fā)表的一篇報(bào)導(dǎo)：他們用轉(zhuǎn)Bt基因玉米花粉的馬利筋葉片來(lái)飼喂大斑蝴蝶幼蟲，對(duì)照組是加普通玉米花粉的馬利筋葉片及不加玉米花粉的馬利筋葉片，結(jié)果轉(zhuǎn)基因玉米花粉的葉片飼喂幼蟲后，第二天死亡10以上，4天后死亡44。而對(duì)照組全部存活。這就說(shuō)明，Bt轉(zhuǎn)基因玉米花粉可能威脅大斑蝴蝶的生存,引起

11、生態(tài)種群的破壞。轉(zhuǎn)基因生物對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)增加殺蟲劑的使用。由于轉(zhuǎn)基因生物可能造成的影響是抗藥基因的特性選擇和轉(zhuǎn)移或漂流到可相容的其他植物中，形成抗性雜草或超級(jí)雜草，具有很強(qiáng)的抗藥性。產(chǎn)生新的農(nóng)田雜草。其原因是由于基因漂流或基因逃逸，如通過(guò)昆蟲傳播花粉引起雜交或基因污染，使近緣種變成新雜草或超級(jí)雜草。轉(zhuǎn)基因植物自身變?yōu)殡s草。由于插入性狀的競(jìng)爭(zhēng)而演變退化為雜草。產(chǎn)生新的病毒。由于不同病毒基因組和轉(zhuǎn)基因作物的病毒外殼蛋白重組而出現(xiàn)新型病毒。廣譜抗除草劑堆積基因群HT的超級(jí)雜草。產(chǎn)生新的作物害蟲。由于病原體與轉(zhuǎn)基因植物相互作用或是草食動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因植物相互作用而出現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)基因害蟲。比方常見(jiàn)害

12、蟲產(chǎn)生抗性，并進(jìn)化增強(qiáng)。對(duì)非目標(biāo)生物的傷害。由于誤食或基因污染導(dǎo)致。例如2002年10月美國(guó)內(nèi)布拉斯加的一塊約一英畝的剛收獲大豆的田里，發(fā)現(xiàn)了三株轉(zhuǎn)基因玉米。這是因?yàn)樯弦荒攴N植的含一種胰島素蛋白的藥用轉(zhuǎn)基因玉米的種子遺留下來(lái)在田里發(fā)芽，結(jié)果導(dǎo)致總價(jià)值270萬(wàn)美元的這一季大豆不得不付之一炬。轉(zhuǎn)基因生物對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)侵入到新的棲息地。通過(guò)昆蟲、鳥類、風(fēng)力等媒介使轉(zhuǎn)基因花粉四處擴(kuò)散，造成基因污染，威脅生物多樣性平安。喪失生物多樣性。轉(zhuǎn)基因生物通過(guò)生存競(jìng)爭(zhēng)、環(huán)境脅迫或其他不確定性因素增加的影響基因、種群或物種，使生物多樣性受損害或者喪失。對(duì)非目標(biāo)外鄉(xiāng)物種的傷害。由于改變互惠共生關(guān)系導(dǎo)致。營(yíng)養(yǎng)

13、循環(huán)和環(huán)境生物地球化學(xué)過(guò)程的改變。生物與非生物環(huán)境的相互作用關(guān)系改變導(dǎo)致。初級(jí)生產(chǎn)力的改變。改變物種的組成和結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)基因植物的不同性狀，都可能導(dǎo)致在不同程度上影響初級(jí)生產(chǎn)力的變化。增大土壤流失。轉(zhuǎn)基因生物對(duì)健康平安的潛在風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)基因食品有毒性嗎？轉(zhuǎn)基因食品可能造成過(guò)敏嗎？轉(zhuǎn)基因食品中的標(biāo)記基因會(huì)不會(huì)有危險(xiǎn)？一些具有抗除草劑或毒殺害蟲功能的基因，是否會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)而影響健康？外源性目的基因轉(zhuǎn)入移植后是否會(huì)產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康的因素？轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類的生殖遺傳是否會(huì)有影響？等等。毒性問(wèn)題：雖然迄今還沒(méi)有具說(shuō)服力的研究報(bào)告說(shuō)明轉(zhuǎn)基因食品GMF的毒性，但由于轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生“非預(yù)

14、期后果，因此由其加工的食品可能存在潛藏的健康風(fēng)險(xiǎn)。例如，據(jù)1998年報(bào)導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯引起大鼠器官生長(zhǎng)異常。英國(guó)2002年的研究稱，轉(zhuǎn)基因大豆制成的漢堡包食用后，在排出的糞便中仍含有轉(zhuǎn)基因DNA的成分，說(shuō)明抗除草劑基因可存在于腸道細(xì)菌內(nèi)并沒(méi)有被完全消化。又如，馬鈴薯中本來(lái)含有毒素茄堿綠馬鈴薯，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中茄堿是增加還消除了呢？過(guò)敏反響問(wèn)題：過(guò)敏性風(fēng)險(xiǎn)史醫(yī)學(xué)上的“變應(yīng)原性風(fēng)險(xiǎn)，一般人和動(dòng)物是非常低的，但轉(zhuǎn)基因作物可能誘發(fā)或家中變應(yīng)原性風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)基因作物帶有外源基因，即具有新的蛋白質(zhì)，這些新蛋白質(zhì)可能引起食用者或接觸者出現(xiàn)過(guò)敏反響。人類在自然環(huán)境中進(jìn)化形成的人體免疫系統(tǒng)可能難以或無(wú)法適應(yīng)轉(zhuǎn)基因生成

15、的新型蛋白質(zhì)而誘發(fā)過(guò)敏癥。例如，安萬(wàn)特公司推出的“星聯(lián)玉米，是含有殺蟲蛋白Cry9C的轉(zhuǎn)基因玉米，結(jié)果少數(shù)人吃了之后引起皮疹、腹瀉或呼吸系統(tǒng)的過(guò)敏反響并有潛伏效應(yīng)。1998年美國(guó)環(huán)保局比準(zhǔn)“星聯(lián)玉米生產(chǎn)時(shí)，明確規(guī)定只準(zhǔn)供動(dòng)物飼料之用，不能作為食品。2000年9月，發(fā)現(xiàn)美國(guó)市場(chǎng)的玉米面餅等300多種產(chǎn)品中含有微量“星聯(lián)玉米，引發(fā)大風(fēng)波。為回收被“星聯(lián)玉米污染的玉米食品，安萬(wàn)特公司花費(fèi)了約10億美元。這就是在轉(zhuǎn)基因平安史上著名的“星聯(lián)玉米事件。抗藥性問(wèn)題：轉(zhuǎn)基因操作中常常需要使用標(biāo)記基因，而抗藥性基因是用得最多的標(biāo)記基因。如氨芐青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因，新霉素抗性基因，放線

16、菌素抗性基因等等。這些抗性基因會(huì)一直存在于植物器官中，通過(guò)食物鏈可能會(huì)被傳入人畜消化系統(tǒng)中細(xì)菌體內(nèi)，使這些細(xì)菌對(duì)抗生素藥物的治療產(chǎn)生抗性。而抗生素是用來(lái)治療各種非常嚴(yán)重疾病的藥物，如果抗生素失效，那么挽救人類生命就成為問(wèn)題。例如，氨基丁卡霉素被認(rèn)為是人類醫(yī)藥中的“保存或“急救抗生素，是國(guó)際醫(yī)藥界儲(chǔ)藏的應(yīng)急“救危藥物，而現(xiàn)在卻為GMO捷足先登，并濫用于多種GMO作為標(biāo)記基因，廣泛在環(huán)境中釋放，在各種動(dòng)植物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗性。有益成分問(wèn)題：研究發(fā)現(xiàn)，外來(lái)基因會(huì)以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物中的有益成分。如英國(guó)倫理與毒性中心的實(shí)驗(yàn)報(bào)告稱：與一般天然大豆相比，在兩種耐除銹劑或抗除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆中

17、具有防癌功能的異黃酮成分分別減少了12和14。GMO中插入的外源性目的基因改變了生物自身原有的復(fù)雜生物化學(xué)路徑，改變了原有的新陳代謝，其生化作用的結(jié)果很難預(yù)料，還可能受環(huán)境條件變化的影響而導(dǎo)致變異。免疫力問(wèn)題：轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品有可能降低動(dòng)物乃至人類的免疫能力。 轉(zhuǎn)基因食品的概念轉(zhuǎn)基因食品是指那些轉(zhuǎn)入由植物、動(dòng)物或微生物的細(xì)胞中提出的基因，從而獲得某些良好特性的生物所制成的食品成為轉(zhuǎn)基因食品或基因改造性食品轉(zhuǎn)基因食品的主要功能：1 高產(chǎn)、生產(chǎn)期短、抗病、抗蟲害和便于運(yùn)輸、儲(chǔ)存2 改造食品營(yíng)養(yǎng)成分含量、防病和增強(qiáng)體質(zhì)抗金屬作物的去除土壤中污染的重金屬能力轉(zhuǎn)基因作物的種類主要有: 大豆、玉米、棉花

18、和油菜等,這四類作物占全部轉(zhuǎn)基因植物的86%，其中75%種植在北美。從轉(zhuǎn)基因作物的性狀來(lái)看,主要有抗除草劑、抗蟲、抗病等幾類。目前世界上轉(zhuǎn)基因作物種植面積最多的是：抗除草劑大豆種占轉(zhuǎn)基因植物總面積的40%；抗蟲玉米占23%；抗病煙草占13%；抗除草劑油菜占10%；抗蟲棉花占8%；抗除草劑棉花占3%。轉(zhuǎn)基因食品的平安性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因食品的平安性評(píng)價(jià)是一個(gè)很復(fù)雜和需要較長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)才能得出結(jié)論的問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因食品的平安性應(yīng)著重從宿主、載體、插入基因、重組DNA、基因表達(dá)產(chǎn)物和對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分的影響幾方面考慮。 轉(zhuǎn)基因食品的平安性評(píng)價(jià)原那么IFBC提出采用判定樹(shù)decision-tree的原那么與方法對(duì)轉(zhuǎn)基因

19、食品進(jìn)行平安性評(píng)價(jià)。1)了解被評(píng)價(jià)食品的遺傳學(xué)背景與基因改造方法；2) 檢測(cè)食品中可能存在的毒素；3)進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。FAO/WHO聯(lián)合專家評(píng)議會(huì)制定的生物技術(shù)食品的平安性評(píng)價(jià)政策與原那么著重強(qiáng)調(diào)：1) 平安性評(píng)價(jià)應(yīng)與科學(xué)為依據(jù)，不能過(guò)高估計(jì)該類食品的危害性，也不能過(guò)低估計(jì)該類食品可能存在的問(wèn)題。2) 任何生物技術(shù)食品的平安性評(píng)價(jià)應(yīng)首先說(shuō)明其分子、生物學(xué)和化學(xué)特性。3) 對(duì)基因改造微生物而制作的食品，如果其分子、生物和化學(xué)分析說(shuō)明與傳統(tǒng)食品一致，那么主要對(duì)其雜質(zhì)和加工過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)，強(qiáng)調(diào)在加工過(guò)程中實(shí)施HACCP和GMP。 4) 對(duì)基因改造的動(dòng)物性食品，動(dòng)物本身的健康可作為平安性評(píng)價(jià)的標(biāo)志。5)

20、 對(duì)已進(jìn)行平安性評(píng)價(jià)并批準(zhǔn)用于消費(fèi)的食品，需進(jìn)行有方案的使用后的人群健康監(jiān)測(cè)。 轉(zhuǎn)基因食品的平安性評(píng)價(jià)的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因食品從營(yíng)養(yǎng)與毒理學(xué)兩方面按個(gè)案進(jìn)行評(píng)價(jià)。在對(duì)一種轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行平安性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)首先了解其背景資料，包括食品名稱、來(lái)源動(dòng)物、植物或微生物、基因改造方法宿主、載體、插入基因、重組生產(chǎn)體的特性、人體攝入量、使用目的及使用人群是否是特殊人群，如孕婦、兒童等、加工方法及食品成分等，同時(shí)確定待評(píng)價(jià)的試驗(yàn)樣品與實(shí)際生產(chǎn)的和人類實(shí)際消費(fèi)的食品是否一樣。1) SAFEST 1類食品：與傳統(tǒng)食品極其相同或相似的基因改造食品，不必進(jìn)一步證明其平安性。2) SAFEST 2類食品：與傳統(tǒng)食品極其相似，但

21、存在某個(gè)新成分或新特性或缺乏某一個(gè)新成分與特性的基因改造食品。需要對(duì)其不同的成分與特性作進(jìn)一步的分析評(píng)價(jià)。3) SAFEST 3類食品：與傳統(tǒng)食品既不相同也不相似的基因改造食品，需要作廣泛的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。1) 關(guān)于急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果;2) 關(guān)于亞急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果;3) 關(guān)于慢性毒性的試驗(yàn)結(jié)果;4) 關(guān)于對(duì)生殖產(chǎn)生影響的試驗(yàn)結(jié)果;5) 關(guān)于變異原性的試驗(yàn)結(jié)果;6) 關(guān)于癌原性的試驗(yàn)結(jié)果;7) 其他必要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(腸道毒性試驗(yàn)結(jié)果等)。實(shí)質(zhì)等同性原那么：即轉(zhuǎn)基因食品和傳統(tǒng)同類產(chǎn)品比較特性、化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)成分、所含毒素等評(píng)價(jià)方法：Monsanto公司的評(píng)價(jià)方法：1插入基因所表達(dá)蛋白的平安性評(píng)價(jià)2營(yíng)養(yǎng)

22、水平的比較3健康顯示測(cè)試全食物飼喂研究數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用活體或離體動(dòng)物模型 轉(zhuǎn)基因食品致敏性的評(píng)價(jià)PCR檢測(cè)的方法國(guó)外對(duì)轉(zhuǎn)基因食品管理的有關(guān)法規(guī)1 在FAO/WHO召開(kāi)的第23屆(1994)食品標(biāo)簽法典委員會(huì)會(huì)議上同意由美國(guó)官方機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)起草?食品標(biāo)簽的生物學(xué)技術(shù)關(guān)聯(lián)指南草案?。美國(guó)方面提出轉(zhuǎn)基因食品平安無(wú)害，應(yīng)與其它食品同等對(duì)待而不必強(qiáng)制性標(biāo)簽。 第25屆(1997) 食品標(biāo)簽法典委員會(huì)會(huì)議對(duì)?指南草案?再次擬稿，提出了一個(gè)?關(guān)于采用生物技術(shù)制備食品的標(biāo)簽的推薦意見(jiàn)?的提案，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品加施GMO(基因改進(jìn)有機(jī)體)標(biāo)簽。2 歐洲議會(huì)于1997年5月15日通過(guò)了?新食品規(guī)程?的決議，規(guī)定歐盟成員國(guó)

23、對(duì)上市的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必需要有GMO的標(biāo)簽,這包括所有轉(zhuǎn)基因食品或含有轉(zhuǎn)基因成分的食品。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括：(1)GMO的來(lái)源；(2)過(guò)敏性；(3)倫理學(xué)考慮；(4)不同于傳統(tǒng)食品(成分、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、效果等)。1998年9月1日歐盟增補(bǔ)了標(biāo)簽指南，規(guī)定來(lái)自于轉(zhuǎn)基因豆類和玉米的食品(目前不包括食品添加劑如大豆卵磷脂)必須標(biāo)簽。如果食品的原料及在加工過(guò)程中沒(méi)有添加轉(zhuǎn)基因的成分，那么可標(biāo)示非轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)簽。3 澳大利亞、新西蘭于1999年5月起實(shí)施?轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)準(zhǔn)?，規(guī)定對(duì)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的食品必須進(jìn)行平安性評(píng)價(jià)，如在平安性評(píng)價(jià)中未獲認(rèn)可，將不得進(jìn)入市場(chǎng)銷售。4 俄羅斯政府規(guī)定，從1999年7月1日起，進(jìn)

24、口轉(zhuǎn)基因食品必須經(jīng)俄有關(guān)部門質(zhì)檢。俄授權(quán)醫(yī)學(xué)科學(xué)院食品研究所和國(guó)家生物工程中心對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行質(zhì)檢。5 瑞士聯(lián)邦政府規(guī)定，食品中轉(zhuǎn)基因成分不超過(guò)1%的，不需在標(biāo)簽上標(biāo)明；超過(guò)1%或無(wú)法確定的，需在標(biāo)簽上說(shuō)明。6 加拿大還沒(méi)有要求強(qiáng)制性地對(duì)所有轉(zhuǎn)基因食品作標(biāo)簽表述，但只要其表述是真實(shí)而無(wú)誤導(dǎo)的，就允許并鼓勵(lì)食品生產(chǎn)商進(jìn)行自愿性的標(biāo)簽表述。當(dāng)基因突變導(dǎo)致對(duì)局部消費(fèi)者造成可能的健康與平安風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，基因工程生產(chǎn)的食品應(yīng)實(shí)行強(qiáng)制性標(biāo)簽要求，比方當(dāng)引入某種的過(guò)敏原或?qū)κ称返臉?gòu)成或營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化時(shí)。我國(guó)的對(duì)策我國(guó)目前還沒(méi)有方法對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測(cè)，也沒(méi)有相應(yīng)的管理方法和法規(guī)來(lái)進(jìn)行監(jiān)管1 借鑒國(guó)外的通行做

25、法，制訂一部專門的法規(guī)來(lái)加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的管理要求出口國(guó)必須對(duì)轉(zhuǎn)基因食品加貼標(biāo)簽檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)的進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施申報(bào)、登記制度。登記內(nèi)容主要包括：產(chǎn)品名稱、來(lái)源動(dòng)物、植物或微生物、基因改造方法宿主、載體、插入基因、重組生產(chǎn)體的特性、人體攝入量、使用目的及使用人群是否是特殊人群，如孕婦、兒童等、加工方法及食品成分等。出口國(guó)應(yīng)向我國(guó)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)提供經(jīng)過(guò)平安評(píng)價(jià)方面的證明，并承諾承擔(dān)種植和消費(fèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能引起的風(fēng)險(xiǎn)。2 加緊開(kāi)展對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)和平安評(píng)價(jià)工作。1加緊開(kāi)展對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)工作2加緊開(kāi)展對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的平安性評(píng)價(jià)工作3 國(guó)內(nèi)公司進(jìn)口食品時(shí)應(yīng)要求外方對(duì)轉(zhuǎn)基因食品予以申明

26、和加貼標(biāo)簽轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢驗(yàn)技術(shù)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的平安性評(píng)估極為重要，但可能更為受到人們關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)。目前要測(cè)試植物產(chǎn)品是否含有基因改造成分，或植物產(chǎn)品是否經(jīng)過(guò)基因改造，主要有兩種方法：1 檢測(cè)是否有外來(lái)基因或DNA；2 檢測(cè)是否有外源的蛋白質(zhì)。方法1是基于PCR技術(shù)，此技術(shù)能檢測(cè)樣本中是否有外耒基因，既使外耒基因量極微，PCR技術(shù)也能精確檢測(cè)，檢測(cè)包括檢測(cè)目標(biāo)基因、標(biāo)記基因和引物等不同方法。由于方法1操作簡(jiǎn)便，結(jié)果精確，所以其是歐美實(shí)驗(yàn)室采用最為廣泛的方法。方法2操作麻煩，有待進(jìn)一步改進(jìn)，局部歐美實(shí)驗(yàn)室亦有采用。第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物p154定義動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的流程轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)

27、物鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用 將特定的目的基因從某一生物體別離出來(lái)，進(jìn)行擴(kuò)增和加工，再導(dǎo)入另一動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到宿主動(dòng)物的染色體上，在動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并通過(guò)生殖細(xì)胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物transgenetic animal。將克隆的外源基因注射到一個(gè)受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長(zhǎng)為后代，其中的局部后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜或種禽，培育新的純合系。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的流程外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選

28、擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇適宜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的流程圖基因的轉(zhuǎn)移的方法電穿孔法顯微注射法磷酸鈣DNA共沉淀法脂質(zhì)載體包埋法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移利用脈沖電場(chǎng)提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡(jiǎn)單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用顯微操作技術(shù)轉(zhuǎn)移外源基因的方法。此法轉(zhuǎn)入基因長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百kb；并能隨機(jī)地整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。但是這種整合有時(shí)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組的重排、易位、缺失或定點(diǎn)突變。磷酸鈣DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)這種方法是受

29、二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而開(kāi)展起來(lái)的。當(dāng)核酸以磷酸鈣DNA共沉淀物的形式在時(shí)，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%5%的外源DNA可以進(jìn)入受體細(xì)胞核中，大約僅有1%的DNA可以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。脂質(zhì)載體包埋法將需要轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法基因顯微注射法胚胎干細(xì)胞移植法反轉(zhuǎn)錄病毒法重點(diǎn)介紹通過(guò)激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開(kāi)始時(shí)注射雌性妊娠血清，48小時(shí)后再注 射人絨毛膜促進(jìn)腺激素，這時(shí)小鼠便會(huì)超數(shù)排卵，一般情況

30、下5-10個(gè)，超 數(shù)排卵為35個(gè)；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi) ；將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi) ；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代 ；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進(jìn)行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位 點(diǎn) ；子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá) 。 DNA顯微注射法的根本程序一、基因顯微注射法顯微注射DNA的制備與純化DNA構(gòu)型和末端結(jié)構(gòu)載體DNA的長(zhǎng)度與濃度溶解DNA的緩沖液DNA的純度鼠的準(zhǔn)備與要求轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)所用各類鼠超排卵與取卵孕馬血清PMS其有效成分為卵泡刺激

31、素FSH。人絨毛膜促性腺激素hGG雌鼠的排卵時(shí)間：雄鼠的排精時(shí)間：受精一般發(fā)生在：1 超排卵制定排卵程序：(1) 于第一日中午先向小鼠腹腔內(nèi)注入5一l 0單位的PMS；(2) 過(guò)48小時(shí)(第三天中午)腹腔內(nèi)注入510單位的人hCG(注射后1113 小時(shí)后排卵)；(3) 令雌雄動(dòng)物一對(duì)一的合籠交配；動(dòng)物半夜交尾，如未發(fā)生交配，兩周后可再重用，但成功率下降；(4) 檢查陰栓(第四日晨)；檢查陰栓可判定是否受精；如已受精那么出現(xiàn)陰栓。2 受精卵的收集(1)檢查陰栓：有白色陰栓的小鼠可用，引頸處死動(dòng)物：(2)取輸卵管：剖開(kāi)腹腔，取出輸卵管，置入含有3ml培養(yǎng)液的60mm直徑的瓶皿中；(3)取卵子；在2

32、0或50解剖鏡下找到輸卵管，在卵管膨大的壺腹部(于卵管開(kāi)口近 處)隱約可見(jiàn)內(nèi)含的胚卵，把胚卵團(tuán)用尖攝輕輕壓擠出，用吸管移入含有400l別離 液的表玻皿中；(4)另準(zhǔn)備45個(gè)瓶皿，每皿內(nèi)均充有胚胎培養(yǎng)基400 l并覆蓋有厚8mm硅烷油或液 體石蠟層(Fisher產(chǎn)，研究用)，硅烷油和石蠟巳預(yù)先在5%CO2中置371時(shí)做平衡 處理，覆硅烷油或石蠟層的目的是為防止培養(yǎng)液蒸發(fā)、散熱和pH改變；(5)向含卵團(tuán)表玻皿的別離液中加5 l新制備的透明質(zhì)酸酶(透明質(zhì)酸酶10mg1ml分 離液，Sigma產(chǎn))，把胚卵團(tuán)消化分散開(kāi)；(6)當(dāng)卵團(tuán)散開(kāi)后，立即把分散游離的卵細(xì)胞用吸管轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，通過(guò)硅油層接 種入任

33、一培養(yǎng)液小滴中)，以去除酶的繼續(xù)作用；(7)再依次通過(guò)皿內(nèi)其余培養(yǎng)液小滴，以繼續(xù)除掉酶和擺脫碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此時(shí)的卵己可用作DNA注射之用。DNA顯微注射制備持卵管與注射針在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細(xì)的約510cm長(zhǎng)的一段，其口徑約80120m，用玻璃刀將其在離頸部2cm處切斷，再把切口燒成如圖形狀，口徑約15 m。將尖部移近火焰噴燈略加熱，用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如下圖角度。由拉針器制成，針的口徑應(yīng)低于1 m。1硅烷油注入：取培養(yǎng)皿或表玻皿，注入已經(jīng)過(guò)平衡處理過(guò)的液體硅烷油或石蠟 厚約5mm；2加培養(yǎng)基：通過(guò)硅烷油或石蠟層向培養(yǎng)皿底接種培養(yǎng)液，以100l為單元的小滴 數(shù)

34、個(gè)，各滴間相距1一2cm(視小滴多少而定)；3胚卵接種：吸取待受注射胚卵數(shù)個(gè)，通過(guò)油層分別接種入培養(yǎng)液小滴中；4DNA準(zhǔn)備：從Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中枯燥， 重懸于注射緩沖液中(含1mgDNAml)，使其最終濃度為：；5于臨注射前把DNA樣品在Eppendorf 管中再離心一次(1200rpm，10分鐘)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口；6把待注射用的DNA裝入注射管中；2 DNA注射7在顯微鏡下把支持吸管轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液小滴中，選一健康胚卵；先吸少量培養(yǎng) 液， 僅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持負(fù)壓狀態(tài)下吸住胚卵，繼 之把支持管調(diào)至皿底令胚卵靠于皿

35、底面中央部；8調(diào)注射針至胚卵近處，先調(diào)顯微鏡焦點(diǎn)看清針尖，然后通過(guò)透明帶刺入胚卵 細(xì)胞膜內(nèi)(小鼠胚卵直徑約10m)，進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)針再刺入任一原核內(nèi)雄性原 核多位于周邊部，體積較大，為主要注射對(duì)象。注射針刺入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行注 射時(shí)，如細(xì)胞核微微發(fā)生膨脹，證明DNA已被注入，反之需重新進(jìn)行注射； 注射細(xì)胞數(shù)量越多越好； 9用支持吸管把已注射細(xì)胞移入另一培養(yǎng)小滴中，使之與未注射細(xì)胞分開(kāi)；待 注射結(jié)束后，把所有細(xì)胞均移入培養(yǎng)液中，置入溫箱培養(yǎng)30分種；10鏡下觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有溶解死亡崩潰者棄掉。體內(nèi)接種1在手術(shù)前夜令受體母鼠與已結(jié)扎輸精管雄性小鼠合籠，次日晨取出雌鼠備用；2取注射吸管兩支，分別作為向兩側(cè)輸卵

36、管注入胚卵之用；先吸入少許培養(yǎng)液，排出后留少許液體并保存一兩個(gè)氣泡，繼之吸入胚卵數(shù)個(gè)(在管腔內(nèi)成串)； 最后仍保存一個(gè)氣泡，以使管內(nèi)胚卵限制于氣泡之間不易移動(dòng)并利于識(shí)別；3 麻醉小鼠，深度適當(dāng)，置動(dòng)物于小手術(shù)平臺(tái)上，呈腹臥位(背朝上)；4 剪出背腎部?jī)蓚?cè)毛，碘酒酒精消毒；5 使動(dòng)物軀干部一側(cè)斜向上，在髂骨和腎臟下方間剪一縱切口，長(zhǎng)2cm；6 輕輕牽出輸卵管，找尋輸卵管口(剛排卵動(dòng)物輸卵管壺腹部微膨脹，內(nèi)可見(jiàn) 成團(tuán)未受精卵子)一手用鑷子輕輕持住輸卵管系膜，另一只手持一個(gè)含有胚 卵的注入管，伸入輸卵管口內(nèi)，把吸管內(nèi)已含有外源DNA的胚卵全部注入 輸卵管內(nèi)；7 把輸卵管及周圍組織送回腹腔內(nèi)；8 仔細(xì)

37、緊密縫合創(chuàng)口，9 再令動(dòng)物倒向另側(cè)；按同樣操作方法向該側(cè)輸卵管內(nèi)輸入同等量的胚卵。優(yōu)點(diǎn)： 轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對(duì)平安 。缺點(diǎn)：整合機(jī)制不明確，無(wú)規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達(dá)；整合位點(diǎn)隨時(shí)機(jī)造成轉(zhuǎn)動(dòng)物基因組的重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求強(qiáng)。 胚胎干細(xì)胞embryonic stem cell，ES是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM別離出來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。胚胎干細(xì)胞方法優(yōu)點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移效率大大提

38、高，且能進(jìn)行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)：需要多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這對(duì)飼養(yǎng)本錢高，產(chǎn)仔數(shù)較少的大型哺乳類動(dòng)物來(lái)說(shuō)，要獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一件需要大量資金投入的事情。通過(guò)物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒(méi)有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。反轉(zhuǎn)錄病毒法優(yōu)點(diǎn)：能有效地將轉(zhuǎn)基因整合入受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機(jī)制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu) 缺點(diǎn)：載量較小，一般只有8kb，可能會(huì)因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)；盡管病毒載體被設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細(xì)胞的包裝過(guò)程中，假設(shè)與整合型輔助表達(dá)基因組發(fā)生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，一般使用受到限制。操作繁瑣。 斑點(diǎn)雜交和PCR擴(kuò)增Southern雜交Northern雜交表達(dá)產(chǎn)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)四、 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)根底研究中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因生物反響器多莉熒光小鼠轉(zhuǎn)基因山羊轉(zhuǎn)基因豬轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物從屠宰場(chǎng)殺掉的奶牛體內(nèi)收集 卵母細(xì)胞，并使之在體外成熟用公牛精液對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn) 行體外