發(fā)酵基因工程菌

1、第八章 基因工程菌培養(yǎng)一、概述基因工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品主要有二類，蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)?；虿僮鳎呵贸虿迦牖蚱?、增強 啟動子代謝工程基因插入載體，轉(zhuǎn)化工程菌1細胞因子、疫苗、酶2二、宿主-載體系統(tǒng) 構(gòu)建基因工程菌，必須選擇宿主和表達系統(tǒng) 要求：翻譯后的修飾要簡單 如果用于食品要考慮宿主菌要求安全， 列入FDA表中常用的宿主系統(tǒng)有：大腸桿菌 G+細菌 低等真核細胞 哺乳動物細胞31、大腸桿菌如果產(chǎn)品翻譯后不需要修飾，最普遍選用大腸桿菌作為宿主。優(yōu)點：人們對大腸桿菌的生理學(xué)和遺傳學(xué)背景了解得比其他任何生物深。有利于進行復(fù)雜的基因操作；大腸桿菌有相當高的生長速率，并能長到高細胞濃度（50g/l）；大腸

2、桿菌能生長在簡單的便宜的培養(yǎng)基上。4大腸桿菌作為宿主的主要問題是大腸桿菌分泌(secretion)的蛋白通常在細胞內(nèi)，當這些蛋白達到高濃度時，會被水解或形成不溶的包含體。包含體蛋白是不折疊的，必須重新溶解并使它復(fù)性。大量的外源蛋白會觸發(fā)熱沖擊響應(yīng)。增加蛋白水解酶的活性。此時，蛋白水解酶使蛋白的降解速率幾乎等于產(chǎn)生的速率。翻譯常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)N端常多一個甲硫氨酸殘基，引起免疫反應(yīng)。5真核基因在大腸桿菌中的表達方式 （1）以融合蛋白的形式表達藥物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。優(yōu)點：操作簡便，蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定；易高效表達；但只能做抗原。 不做人體

3、注射用藥。 （2）以非融合蛋白的形式表達藥物基因：易被蛋白酶破壞；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反應(yīng)。（3）分泌型表達蛋白藥物基因：外源基因融合到原核蛋白信號肽序列的下游。62、G+細菌 枯草桿菌是G+菌，沒有外膜，能把蛋白分泌（excretion）到胞外。不能使蛋白質(zhì)糖基化缺陷:枯草桿菌產(chǎn)生大量的蛋白酶，會很快降解產(chǎn)物。而且枯草桿菌基因構(gòu)建比大腸桿菌困難，質(zhì)粒穩(wěn)定性也比較差其他: 鏈霉菌：不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。73、低等真核細胞酵母菌 釀酒酵母是第一個被人利用的生物現(xiàn)在發(fā)展了其他的酵母如甲醇營養(yǎng)型酵母等優(yōu)點 生長快 最大生

4、長速率是大腸桿菌的25%個體大 酵母比最大的細菌大，容易從發(fā)酵液中回收。不產(chǎn)內(nèi)毒素有簡單糖基化能力和分泌蛋白的能力。缺點 酵母達到高表達水平比大腸桿菌困難，外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能簡單糖基化。當產(chǎn)生的外源蛋白需要復(fù)雜的糖基化和翻譯后修飾時，要用動物細胞組織培養(yǎng)來達到。8影響目的基因在酵母菌中表達的因素 （1）外源基因拷貝數(shù)：高度穩(wěn)定、高拷貝 （2）外源基因的表達效率：啟動子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影響：菌體生長力強；菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；菌株性能穩(wěn)定；分泌能力強。絲狀真菌：很強的分泌能力；能正確進行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀

5、真菌（如曲霉）被確認是安全菌珠，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。 94、哺乳動物細胞哺乳動物細胞在表達時有正確的氨基酸排列，而且所有轉(zhuǎn)譯后處理（修飾）與在整個動物中相同，在某種情況下可能轉(zhuǎn)譯后修飾有些不同，但它可提供最接近于天然副本的產(chǎn)物，此外多數(shù)產(chǎn)物可以分泌到胞外。但動物細胞生長緩慢，培養(yǎng)基價格昂貴，蛋白表達水平較低。用于重組DNA 生產(chǎn)蛋白的最常用的宿主是CHO（中國倉鼠卵巢細胞）。10 三類主要基因工程表達體系的比較表達體系 產(chǎn)物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 產(chǎn)物活性 淺在危險大腸桿菌 多肽、蛋白 菌內(nèi) 部分可高產(chǎn) 對原核好 不大 融合蛋白 酵 母 多肽、蛋白 菌內(nèi) 可高產(chǎn) 真核接近 不大 糖基化蛋白

6、 胞外 天然動物細胞 完整 胞外 幾乎可為 可能有 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 天然產(chǎn)物 致癌因素11三、利用基因工程菌生產(chǎn)的特點（一）基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能在質(zhì)粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失質(zhì)粒的菌生長快得多，這樣就會大大降低產(chǎn)物的表達。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素。（二）基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達。12（三）基因不穩(wěn)定性生產(chǎn)的目標是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對宿主細胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細胞一般生長得

7、快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性?；虻牟环€(wěn)定性原因：分離丟失結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性宿主細胞調(diào)節(jié)突變 131、分離丟失 指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。為什么會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失呢？質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)粒（20拷貝/細胞）和低拷貝質(zhì)粒（有時低到每個細胞一至二個拷貝）。低拷貝質(zhì)粒有專門的機制保證在子代細胞中有相等的分配，高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細胞。對于高拷貝質(zhì)粒，絕大多數(shù)子細胞接受一些質(zhì)粒，也有可能有的細胞沒有接受質(zhì)粒，出現(xiàn)質(zhì)粒丟失。雖然形成無質(zhì)粒細胞的可能性是低的（每百萬細胞分裂中一個）。14在大的反應(yīng)器中含有非常多的細胞，總會存在無質(zhì)粒細胞，例如100

8、0L發(fā)酵液，每毫升有109個細胞，總共就有1015個細胞，那么在這個反應(yīng)器中就含有109個無質(zhì)粒細胞。質(zhì)粒的分離丟失受許多環(huán)境因素影響，如溶氧、溫度、培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質(zhì)粒也會形成多聚體，它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個單位。15分離丟失示意圖162、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。如果質(zhì)粒發(fā)生突變，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。而且由于不合成外源蛋白，生長得比原來的工程菌更快，使得在這種培養(yǎng)物中帶有突變質(zhì)粒的菌占統(tǒng)治地位，這種培養(yǎng)情況就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。173、宿主細胞突變

9、宿主細胞的突變也會造成生產(chǎn)能力的下降。這些突變通常改變細胞調(diào)節(jié)，結(jié)果減少目標蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達的啟動子，利用宿主細胞的啟動子，如果宿主細胞啟動子的改變，將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過加入乳糖或它的結(jié)構(gòu)類似物（如IPTG）來啟動表達，如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會阻止乳糖或乳糖的結(jié)構(gòu)類似物進入細胞，從而不能啟動細胞的表達。184、生長速率占優(yōu)勢的不穩(wěn)定性所有這三種因素的關(guān)鍵是變異了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主-載體系統(tǒng)的生長速率不同。如果變異了的宿主載體系統(tǒng)比原來的宿主-載體系統(tǒng)有生長優(yōu)勢，那么變異了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢，基因不穩(wěn)定性就

10、出現(xiàn)。 （四）表達的誘導(dǎo)基因工程菌的產(chǎn)物表達需要誘導(dǎo)，誘因主要有：溫度誘導(dǎo)、乳糖或乳糖結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)、氧饑餓誘導(dǎo)、葡萄糖饑餓誘導(dǎo)、甲醇誘導(dǎo)等。19提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 1、兩階段培養(yǎng)法：第一階段使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達。在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟 失菌的生長。 2、通過控制環(huán)境參數(shù)（溫度、PH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度），調(diào)節(jié)比 生長速率，使工程菌生長具有優(yōu)勢。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變 比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比 生長速率，可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。20四、重組大腸桿菌的培養(yǎng)策略關(guān)鍵點：高密度、高表達菌密度的測定：

11、光密度（OD值或A值）在波長600660nm菌生長的障礙是重組菌攜帶外源基因，加重代謝負擔，生長緩慢外源蛋白不能分泌到胞外，在菌體內(nèi)合成后就會造成積累。高表達的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白對菌體有害，對細胞生長有抑制作用，甚至?xí)?dǎo)致細胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生長速率往往遠小于宿主菌。21高表達的障礙是：外源基因的不穩(wěn)定，造成表達的下降高生長速率與高表達之間的矛盾乙酸的產(chǎn)生蛋白的降解22 高密度培養(yǎng)的措施分批補料培養(yǎng) 以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點，可消除高濃度底物對細胞生長的抑制作用，還可以彌補低濃度底物限制細胞生長的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長過程。因此，要實現(xiàn)重組大腸桿菌

12、的高密度培養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批流加補料培養(yǎng)法?，F(xiàn)在常用的是反饋補料培養(yǎng)。有幾種反饋控制 23控制基質(zhì)濃度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生長速率的葡萄糖流加241、控制基質(zhì)濃度流加用專門的電極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測發(fā)酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通過反饋系統(tǒng)與補糖單元相連。當葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當葡萄糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時，糖閥開啟，葡萄糖以一定速率加入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效應(yīng)，達到很高的細胞濃度。252、恒pH流加大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長，pH會上升。這是由于菌體分解LB培

13、養(yǎng)基中的胰蛋白胨，造成氨積累的原因。因此用葡萄糖代替酸液進行恒pH流加。實驗通過pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使pH恒定，結(jié)果推遲了比生長速率降低的時間，細胞密度是無流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時流加氨水和葡萄糖。這種方法的缺點是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對某些工程菌不適宜。263、恒溶氧流加用復(fù)膜氧電極來控制補糖。當培養(yǎng)液的氧飽和百分數(shù)高于控制點，糖閥開啟，以一定速率補糖。加入的糖被菌利用則需要更多的氧，從而降低溶氧濃度，引起讀數(shù)下降。當讀數(shù)下降到控制點以下，糖閥關(guān)閉，需氧就會隨之減少，溶氧逐漸上升，從而達到供需平衡。Konstantinov等進一

14、步發(fā)展了這種方法，用DO-state法間歇流加葡萄糖，通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達274、控制比生長速率的葡萄糖流加菌體的比生長速率與代謝產(chǎn)物的表達密切相關(guān)。比生長速率太大，超過某一值，易產(chǎn)生乙酸，這一比生長速率值稱為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長速率。通過考察得出最優(yōu)比生長速率，控制溶氧、轉(zhuǎn)速、補糖來控制比生長速率。28五、生長與表達的影響因素 不同發(fā)酵條件下工程菌發(fā)酵結(jié)果 通氣量 攪拌轉(zhuǎn)速 DO pH OD600 誘導(dǎo)時間 菌體濕重 蛋白量1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%2 2 250 2.6 7.8 0.77 4

15、2.08 16.7%3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%*鯉魚生長激素基因工程菌291、溶氧濃度對工程菌發(fā)酵的影響在鯉魚生長激素基因工程菌的發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵液的溶氧為1.82.6ppm/L時，菌體濕重為1.92.08g/L外源基因表達量為13.8%16.7%，而當溶氧值提高到4.0ppm/L時菌體濕重為2.27g/L外源基因表達量為26.4%。在誘導(dǎo)表達期間，要維持外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯，細胞需要大量的能量代謝以促進呼吸作用

16、。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。302、pH值對工程菌生長和表達的影響在相同通氣量和攪拌速度下，pH值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達有一定影響。由于工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)工藝，前期為菌體生長階段，后期為蛋白誘導(dǎo)表達階段。偏堿性的pH對外源蛋白的表達不利，因此，表達時要調(diào)節(jié)pH在6.8-7.0之間，以保證外源蛋白的高水平表達。313、誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達的影響 誘導(dǎo)時間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時間隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。誘導(dǎo)

17、時間對酶表達水平和活力的影響誘導(dǎo)時間 酶活力 酶表達水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64%*L-天冬酰氨酶324、誘導(dǎo)時機對表達的影響誘導(dǎo)時機指加入誘導(dǎo)劑的時間以天冬酰氨酶表達為例，見表。在A600=0.295*10時生長速度比較快，這時菌體進入誘導(dǎo)狀態(tài)，酶蛋白的積累加快，酶活和表達水平都較高。而菌體進入對數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長速度受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo)，表達顯然受到影響。33 誘導(dǎo)時機對酶表達水平和活力的影響生物量（A600） 酶活力 酶表達水平 0.

18、015 6.0 15.0% 0.049 19.1 31.1% 0.160 72.5 41.5% 0.225 102.6 49.8% 0.295 165.0 57.7% 0.360 105.5 53.4% 0.410 62.4 44.5% 0.450 30.2 22.5%*L-天冬酰氨酶0.0340.1110.0650.070.0650.050.04345、乙酸對生長和表達的影響（1）乙酸的產(chǎn)生及抑制作用機理 當葡萄糖加入量超過菌體生長和二氧化碳產(chǎn)生所需要量或在缺氧的條件下便會產(chǎn)生大量的乙酸，特別是在培養(yǎng)時間較長的高密度發(fā)酵過程中，問題更為嚴重。 為什么會產(chǎn)生乙酸？Han認為細菌在低比生長速率下

19、通過氧化代謝（三羧酸循環(huán)）的作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化的需求，不會產(chǎn)生乙酸，而在髙比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑提供ATP和NADH。35乙酸的生成需要兩個關(guān)鍵性的酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應(yīng)。EL-Mansi和Luli假設(shè)的乙酸抑制機理是：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細胞質(zhì)膜進入胞內(nèi)，在細胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差減小，減

20、弱了質(zhì)子的推動力，產(chǎn)生的能量就被大大減少，擾亂了細胞的正常代謝和生理活性。36（2）減少乙酸積累的對策宿主菌不同的宿主產(chǎn)生乙酸不同，可通過誘變使乙酸生成途徑中的兩個關(guān)鍵酶，有一個突變了或活性降低了，使乙酸合成受阻。37培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成能影響乙酸的產(chǎn)生，特別是碳源的含量影響最大。在基本培養(yǎng)基中大腸桿菌產(chǎn)生的乙酸比在復(fù)合培養(yǎng)基中產(chǎn)生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培養(yǎng)基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）減輕了乙酸的抑制作用，提高了重組菌的生長速率和重組蛋白的產(chǎn)率。 Klemam等研究了培養(yǎng)基pH值對產(chǎn)生乙酸的影響，發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌W3200在葡萄糖濃度為5g/L、pH6.0

21、的培養(yǎng)基中乙酸生成量為6g/L.而pH7.5為12g/L。38降低比生長速率細菌比生長速率高，乙酸的比生成速率就高，一般來說，在合成培養(yǎng)基中，當重組菌的生長速率超過某個臨界值便產(chǎn)生乙酸。在連續(xù)培養(yǎng)中，當稀釋速率超過0.2h1才能檢測到乙酸的存在。較低的比生長速率雖然產(chǎn)酸少，但同時對產(chǎn)物表達不利，因此選取合適的比生長速率才能達到高密度、高表達發(fā)酵。降低培養(yǎng)溫度將溫度從370C降低到26-300C可以降低菌體對營養(yǎng)物的吸收率，從而減少有機酸的形成。39透析培養(yǎng)在重組菌的培養(yǎng)過程中可以利用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中有害物質(zhì)，降低乙酸的含量從而實現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵。Lee等用中空纖維膜過濾裝置除去乙酸，可

22、以在較高的葡萄糖濃度下培養(yǎng)重組菌而得到較高的密度40限制性流加葡萄糖利用葡萄糖為碳源培養(yǎng)重組大腸桿菌時要控制其濃度在較低的范圍內(nèi)，減少乙酸的生成。如pH，OUR，CER作為控制對象，和葡萄糖流加相關(guān)聯(lián)，控制流加量，使培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度限定在較低水平。41六、甲醇營養(yǎng)型酵母的生長和表達 （一）酵母作為宿主菌的優(yōu)點單細胞低等真核生物，易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工的功能，具有適合于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)分泌外源蛋白質(zhì)到培養(yǎng)液中，利于純化。42 釀酒酵母最先內(nèi)用來作為外源基因的表達宿主菌之一，由于人們對釀酒酵母的遺傳學(xué)和生理學(xué)背景了解得

23、多，及其表達的安全性。但釀酒酵母表達系統(tǒng)也存在一些問題：缺乏強有力的嚴格調(diào)控的啟動子。目前一些常用的啟動子很難精確控制或需要大量昂貴的誘導(dǎo)物，如半乳糖苷酶啟動子需要半乳糖的誘導(dǎo)；分泌效率低，特別是對分子量大于30KD的外源蛋白幾乎不分泌；表達菌株不夠穩(wěn)定，表達質(zhì)粒易于丟失；不適于高密度培養(yǎng)。43（二）甲醇營養(yǎng)型酵母甲醇營養(yǎng)型酵母主要包括Candida、Torulopsis、 Hansenula、Pichia。用作表達宿主株的主要是Hansenula和Pichia?；谝陨系膯栴}，人們發(fā)展了甲醇營養(yǎng)型酵母作為第二代酵母表達系統(tǒng)。44甲醇營養(yǎng)型酵母的重要特性是能利用甲醇作為唯一的碳源和能量來源。因

24、為甲醇能誘導(dǎo)其表達甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶（Alcohol Oxidase,AOX）二羥丙酮合成酶（Dihydroxy-acetone synthase,DHAS）和過氧化氫酶（Catalase），表達的DHAS的含量甚至可達到總細胞蛋白的60-80%。而當以葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源時，AOX幾乎不表達。45進一步研究表明，AOX的表達是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其啟動子能非常有效地控制外源基因的表達。已經(jīng)在P.pastoris染色體中鑒定了二個AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1編碼的蛋白質(zhì)與AOX2編碼的蛋白質(zhì)有97%的同源性，但AOX1基因的啟動子（PAOX1）受甲醇強烈誘導(dǎo)，而PAO

25、X2則很弱。H.polymorpha染色體只有一個AOX基因，也受甲醇調(diào)節(jié)。46甲醇營養(yǎng)性酵母的另一個特點是甲醇代謝所需的三種酶被分揀轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體中，形成區(qū)域化。在葡萄糖為碳源時，菌體中只有一個或幾個很小的過氧化物酶體，而在甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎占到整個細胞體積的80%，里面的蛋白質(zhì)主要AOX和DHAS。47自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表達乙型肝炎表面抗原以來，短短幾年間，至少有40多種外源蛋白在P.pastoris 和H.polymorpha中獲得表達。表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中或聚集在胞漿，表達量最高的可達全菌蛋白的32%或每升12g產(chǎn)物。H.polym

26、orpha表達比P.pastoris有更多的優(yōu)點，如更高的耐熱性（理想溫度為37-430C，而P.pastoris為300C）和在甲醇誘導(dǎo)下更快的生長速率，可減少培養(yǎng)時間，降低污染機會。 H.polymorpha更適于大分子量蛋白（150KD）的表達與分泌。48為了提高外源蛋白在酵母細胞中的穩(wěn)定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下幾種方法：在培養(yǎng)液中補加一些富含氨基酸的組分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，給酵母細胞蛋白酶提供過量的底物，以減少目的蛋白的水解；由于P.pastoris能耐受較寬的pH范圍（pH3.0-7.0），因此可調(diào)培養(yǎng)液pH 值抑制蛋白水解酶活性；改造P.pastoris表達宿

27、主菌株，缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白穩(wěn)定。49酵母細胞是真核生物，具有一些亞細胞結(jié)構(gòu)，如過氧化物酶體等，它們對細胞的功能極端重要，過氧化物酶體內(nèi)不含DNA，也無蛋白質(zhì)合成機制，所有過氧化物酶體內(nèi)的蛋白都由核基因編碼表達，再轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體。因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中必定存在一些進入過氧化物酶體所必須的局部信息。如果把外源蛋白運輸進入過氧化物酶體儲存起來，不僅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其穩(wěn)定性，還可減少外源蛋白對宿主的毒害作用。目前已鑒定出二種甲醇營養(yǎng)型酵母分揀外源蛋白進入過氧化物酶體所需的靶信號PTS1和PTS2。50由于甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)具有以下的優(yōu)點（1）應(yīng)用AOX啟動子

28、，轉(zhuǎn)錄效率高，易于誘發(fā)調(diào)控；（2）表達質(zhì)粒易于整合到基因組，不易丟失，適于高密度發(fā)酵，產(chǎn)量高；（3）表達產(chǎn)物分揀進入過氧化物酶體等.因此最近十幾年來，人們越來越多的應(yīng)用它作為外源基因表達的系統(tǒng)。51（三）甲醇營養(yǎng)型酵母培養(yǎng)中的影響因素1、甲醇濃度的影響例：基因工程菌P.Pestoris表達（人骨唾液酸）rHSA按搖瓶培養(yǎng)方法每24h分別補加甲醇使其在培養(yǎng)基中濃度為5、10、20、30、40、50gL誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，結(jié)果見表2(表中數(shù)據(jù)為2個發(fā)酵瓶平均值)。52 在甲醇濃度為10gL時畢赤酵母表達目的蛋白量達到最高，這可能是當甲醇濃度小于10gL，甲醇成為限制性底物，限制了蛋白的表達當濃度高于2

29、0gL時，甲酵濃度過高，對菌的生長和目的蛋白的表達有抑制作用。因此，在搖瓶條件下，甲醇的最佳誘導(dǎo)濃度為10gL。532、pH對基因工程菌P.Pastoris表達rHSA的影響按搖瓶培養(yǎng)方法，把菌種接至用0.2mol/L的磷酸緩沖液配制好的搖瓶培養(yǎng)基中，pH分別為5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至終濃度10gL進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。5455由基因工程菌P.Pastoris表達目的蛋白和細胞光密度曲線(圖1)可以看出pH為5.84時目的蛋白表達量最高。pH為5.43時，目的蛋白基本沒有表達，但細胞光密度極大，說明在低pH值條件下，適合細胞生長而不適合目的的蛋白表達；當pH值在5.727.00時，細胞光密度基本相同，而目的蛋白表達量基本是呈逐漸下降的趨勢，pH為7.05時，目的蛋白表達量明顯下降。因此，既利于P.P