PapSEEK一種子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌早篩新方法

1、Evaluation of liquid from the Papanicolaou test and otherliquid biopsies for the detection of endometrial and ovariancancersSCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE婦科癌癥篩查研究背景婦科三大癌癥：子宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，卵巢癌巴氏涂片（Pap test）可用于早期子宮頸癌篩查，顯著降低致死率；但是子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌目前缺乏可靠的早期篩查方法目前子宮內(nèi)膜癌的主要檢測方法：陰道超聲無法分清良性惡性；假陽性率高，50個(gè)檢出陽性中只有一個(gè)是真陽性目前卵巢癌主要

2、檢測方法： 蛋白標(biāo)志物CA-125和陰道超聲占卵巢癌90%的高級(jí)別惡性月中瘤很多由輸卵管癌轉(zhuǎn)移而來，不易發(fā)現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)即為晚期，5年生存率低于30%迫切需要建立可靠的子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌早期篩查方法 本文提出：“PapSEEK-婦科癌癥早篩新方法 兩種brush取樣方法+外周血+兩個(gè)參數(shù)分析Aimer cete coleciQiJ fwn里”產(chǎn)白Pap brush sampleTunpr Ela glgedPapSEEK方法流程Pabru如祥本Tao HnjEh樣本血案弊本阻裕樣本祖陽樣本提時(shí)IA提MIANGS方法概序體細(xì)胸突變 染色體非整倍體變異任有檢出因?yàn)殛柍晟先栃詷颖厩闆r總?cè)藬?shù)165 8人6

3、587 1002患者健康人402、254、子宮內(nèi)膜癌 卵巢癌總樣本數(shù)1弓15個(gè)Pmp brush樣本382M5 714子宮內(nèi)臏癌卵梁癌健康人1口 brush樣本12351125子宮內(nèi)腺癌卵巢痛健康人g7例有 206例有組稅樣本 用織樣本g3例有仄紫樣木堂T瑞鬻45例有岬樣本體細(xì)胞突變檢出方法3輪PCR、139對(duì)弓I物，擴(kuò)增片段 110-142 bp覆蓋 18 個(gè)基因：AKT1, APC, BRAF, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, FBXW7, FGFR2, KRAS, MAPK1, NRAS, PIK3CA, PIK3R1, POLE, PPP2R1A, PTEN, RNF43,

4、 and TP53.覆蓋9392個(gè)位點(diǎn)UID設(shè)計(jì)：14個(gè)隨機(jī)排列的堿基某個(gè)突變有包含同一個(gè)UID的大于90%的reads支持即為真過濾標(biāo)準(zhǔn)：一.突變需滿足以下兩條標(biāo)準(zhǔn)之一：.在COSMIC中有記錄.預(yù)測為抑癌基因的失活突變（無義突變，讀碼框外的插入或缺失突變，經(jīng)典的 剪切位點(diǎn)突變）.排除掉同義突變（終止子突變除外）和內(nèi)含子突變（剪切位點(diǎn)突變除外）。.若檢出的突變不能與hg39有唯一比對(duì)（read能比對(duì)上多個(gè)位置）則排除。方法參考文獻(xiàn)：I. Kinde, J. Wu, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. Vogelstein, Detection and qua

5、ntification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108, 9530 - 9535 （2011）.非整倍體變異的檢出方法對(duì)每個(gè)樣本用一對(duì)引物，擴(kuò)增基因組上 38.000 loci of LINESo其中一 個(gè)引物上包含UID序列。用 Within-Sample AneupLoidy DetectiOn （WALDO）軟件分析單個(gè)染色體 臂增加或缺失，以及39個(gè)染色體臂上的等位基因不平衡特征。WALDO整合了一個(gè)支持向量機(jī)（SVM ）來區(qū)分非整倍體和整倍體的

6、樣 本。SVM是由3150個(gè)合成的低月中瘤含量的非整倍體樣本和677個(gè)整倍體外周血白細(xì)胞樣本訓(xùn)練而來。若SVM區(qū)分的分?jǐn)?shù)超過給定值或檢出 7號(hào)和8號(hào)染色體臂的增加，則 此樣本定義為檢出陽性。因?yàn)?號(hào)和8號(hào)染色體的臂增加是子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌 的常見分子指征。方法參考文獻(xiàn)：I. Kinde, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. V ogelstein, FAST-SeqS: A simple and efficient method for the detection of aneuploidy by massively parallel sequencing.

7、PLOS ONE 7,e41162 （2012）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果. Pap brush樣本的體細(xì)胞突變和非整倍體檢出情況 An*u ploidySomatic mutationsCombined dsyPap brush samplesPapSEEK 法 (Combined assay):提高子宮內(nèi)膜癌檢出率至81% (78%早期& 92%晚期)常見突變基因：PTEN (64%), TP53 (41%), PIK3CA (31%), PIK3R1 (29%), CTNNB1 (21%), KRAS (18%), FGFR2(11%), POLE (9%), APC (9%), FBXW7 (8%),

8、 RNF43 (7%), and PPP2R1A.提高卵巢癌檢出率至33% (34%早期& 33%晚期)常見突變基因：TP53 (74%)樣本類型1樣本突變檢出（早&晚）平均MM非整倍體檢出（早&晚）f宮內(nèi)膜痛3S281% (78% &B9%)4.0%弱男仆4% & 51輿）組織對(duì)照31798嚼(driver gene)卵巢癌24529% (28%&3曲0.54%11% (15% & 9,3%)組織對(duì)照20682% (driver gene)健康人71413% (driver gene)1例. Tao brush樣本的體細(xì)胞突變和非整倍體檢出情況Aneu ploidy Somatic muta

9、tionsTa brush samples熏2二普a工二吊七PapSEEK 法 (Combined assay):檢出常見基因突變：PTEN (63%), TP53 (42%), PIK3CA (36%), PIK3R1 (20%), KRAS (17%), CTNNB1 (15%), FGFR2 (15%), RNF43 (11%), PPP2R1A (7%), POLE (7%), and FBXW7 (6%)167EndoEt 同 c-tncvrOvariian urrnr/ 24S18樣本類型數(shù)量P聊SEEK陽性(早期&晚期)平均MAF子宮內(nèi)膜癌12393% (90% &98%)，其中

10、97%對(duì)理組紈陽性24.7%組織對(duì)照11097%,其中93% brush樣本陽性卵巢癌5145% (47%&44%),其中53%對(duì)照組織陽性0.88%蛆織對(duì)照4sSO%,其中42網(wǎng)在brush樣本陽性健康人1250Pap BrushSomatk iriurtjrt&HiAneupladyTao Brush84Ovtirln uncer(-n)Somiiic imutdda-nii AiwuplsdyPapSEEK法：體細(xì)胞突變和非整倍體兩指標(biāo)相結(jié)合可以提高陽性檢出率.兩種取樣方法在兩種癌癥中得到的檢出率比較Endometna cancersBo制的加-浸 j E2BE4L P:。brushOv

11、arian cancersTao brush樣本陽性檢出率均高于 Pap brush樣本，更優(yōu)越！ 子宮內(nèi)膜癌早期檢出率低于晚期，卵巢癌早期晚期檢出率相當(dāng) 可能的原因：有些卵巢癌發(fā)生于輸卵管，輸卵管的癌細(xì)胞可進(jìn)入宮腔被PapSEEK檢測至I;卵巢癌晚期，輸卵管通常已被破壞，病灶的癌細(xì)胞不易進(jìn)入宮腔。針對(duì)這種情況， 測血漿DNA會(huì)更有益。采自同一病人的 Pap brush樣本 &Tao brush樣本 PapSEEK陽性檢出率 比較：103例子宮內(nèi)膜癌：82% & 91%, 42例卵巢癌：17% & 45%,說明Tao brush取 樣法更好！.由于卵巢癌brush樣本檢出結(jié)果不理想，檢測血漿

12、cfDNA驗(yàn)證83例有Pap brush樣本的患者取外周血引物覆蓋16個(gè)靶基因的1933個(gè)不同區(qū)域比較Pap樣本和血漿檢出結(jié)果Pa( samples lone Plasma samples alone 8ath Pap and plasmahi州加勃43如。 1一般)各odC。一tluILPap brush Plasmagen 口me1619,小83）血漿檢出率43% （早期35% &晚期56%）,對(duì)比Pap樣本陽性率40%, 兩者陽性檢出有部分重合血漿早期MAF 0.85%,低于Pap樣本5.7%血漿陽性的患者組織陽性的比率為 88%小結(jié)-PapSEEK法檢測兩癌的結(jié)果P* brul| Hr

13、nfriwTao Hu抑蛤 op FS5屏 tnd Pj 口 tvn pto-大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌能被檢測到:93% Tao brush#本 & 81% Pap brush 樣本小部分卵巢癌能被檢測到：45% Tao brush#本 & 33% Pap brush 樣本健康人基本檢測不到：0% Tao brush樣本 & 1.4% Pap brush 樣本卵巢癌：Pap brush樣本+血漿檢測能提高檢出率到63%Tao brush樣本+血漿也許能表現(xiàn)更好？研究中的不足和需要改進(jìn)的地方1.PapSEEK研究為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，即都是已確診的患者 需設(shè)定無偏好性的患者組驗(yàn)證 PapSEEK方法 需入組良性

14、和惡性患者作比較2.在卵巢癌樣本中，有些在Pap或Tao brush中有突變檢出的患者在對(duì)照組織中 無檢出?？赡艿脑颍涸轮辛霎愘|(zhì)性造成的檢出差異有些卵巢癌患者同時(shí)有子宮內(nèi)膜癌或者惡性子宮內(nèi)膜病變，醫(yī)生不易發(fā) 現(xiàn)非惡性細(xì)胞的克隆型增殖。如子宮內(nèi)膜異位就是這類細(xì)胞增殖導(dǎo)致的。而有報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)的基因突變可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖?？寺⌒栽鲋骋鸬耐蛔兛赡茉斐杉訇栃?，但如果能證實(shí)卵巢癌患者通常會(huì)發(fā)生大量細(xì)胞克 隆型增殖的現(xiàn)象，也可能使卵巢癌檢測的靈敏性增加。故有待進(jìn)一步研究文章作者下一步的計(jì)劃大規(guī)模的PapSEEK篩查臨床試驗(yàn)入組婦科癌癥高危人群，如有遺傳因素、肥胖、有早期癥狀如絕經(jīng)后不 規(guī)律陰道出血的待查婦女試驗(yàn)中需要考慮的