柱前衍生高效液相色譜法分析橘小實蠅蛋白餌劑中的氨基酸

1、基金項目：農(nóng)業(yè)部“948”項目（2009Z40），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903047），福建省科技廳重點項目（2010I0002）作者簡介：韓英（1985-），女，碩士研究生，主要從事害蟲生物防治研究。Email: 通訊作者：陳家驊（1938-），教授，博士生導師，主要從事昆蟲分類和害蟲生物防治研究。Email:chenjh34柱前衍生高效液相色譜法分析橘小實蠅蛋白餌劑中的氨基酸韓英1，許 晨2，許建中2，陳家驊1*，王波1（1. 福建農(nóng)林大學益蟲研究所，福州 350002； 2.國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005）摘要：采用柱前衍生高效液相色譜法（AccQTag法）測定

2、兩種橘小實蠅蛋白餌劑中的氨基酸種類及含量，結(jié)果表明兩種蛋白餌劑中均含有17種游離氨基酸，18種多肽氨基酸。馬來西亞Pupuk Alam公司生產(chǎn)的Prima蛋白餌劑游離氨基酸含量為573.64 mg/100ml，多肽氨基酸含量為5284.76 mg/100ml，多肽含量為4711.12 mg/100ml；本課題組自行研制的橘小實蠅蛋白餌劑游離氨基酸含量為630.10mg/100ml，多肽氨基酸含量為6562.43mg/100ml，多肽含量為5932.33 mg/100ml。關(guān)鍵詞：橘小實蠅蛋白餌劑；游離氨基酸；多肽氨基酸1 引言近年來，隨著人們環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展意識的增強，綜合應用蛋白餌劑、昆蟲不

3、育技術(shù)（SIT，Sterile Insect Technique）和釋放寄生蜂逐漸成為國內(nèi)外防控實蠅類害蟲的主要措施1。應用蛋白餌劑防治橘小實蠅，是繼化學藥劑防治之后發(fā)展起來的一種重要的生物防治方法2-5，該法具有使用方便、對環(huán)境無污染6、不產(chǎn)生害蟲抗藥性、不污染果實7、對人和有益昆蟲無毒等優(yōu)點8。美國、印度、澳大利亞等實蠅發(fā)生重災國家早在20世紀50年代已開始用蛋白餌劑防治實蠅害蟲3，目前國內(nèi)市場上的蛋白餌劑有陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)的GF-120（0.02%獵蠅）和馬來西亞的Prima，我國還沒有屬于自己的蛋白餌劑品牌，本課題組研發(fā)了一種新型實蠅蛋白餌劑8，正在部分地區(qū)開展試用。氨基酸是調(diào)節(jié)機體生

4、理活動的重要物質(zhì)9，實蠅繁殖后代需吸收小分子的蛋白質(zhì)，它們的口器只能取食0.5-1.0m的微小的小分子短鏈蛋白質(zhì)、小肽或氨基酸。由于蛋白餌劑中構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸數(shù)量的相對比例也會直接影響到蛋白餌劑的引誘效果，所以傳統(tǒng)的以蛋白餌劑中粗蛋白的含量來衡量蛋白餌劑優(yōu)劣的方法漸漸顯示出其不足。所以，氨基酸的組成及含量分析逐漸成為衡量蛋白餌劑引誘效果的一項重要指標。本研究主要通過柱前衍生法對比研究市場化的蛋白餌劑產(chǎn)品Prima和本課題組研發(fā)的橘小實蠅蛋白餌劑中氨基酸種類及含量，旨在比較兩者氨基酸的差別，為蛋白餌劑的工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控提供方法依據(jù)。2 材料與方法2.1試驗材料Prima蛋白餌劑：馬來西亞

5、Pupuk Alam 公司生產(chǎn)；本課題組自制橘小實蠅蛋白餌劑：啤酒廢酵母經(jīng)濃縮、破壁、酶解等工藝加工后獲得。2.2儀器與試劑Waters-e2695高效液相色譜儀， 2998二極管陣列檢測器、色譜工作站（美國Waters 公司）、真空烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）、電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、離心機、移液器、安瓿管。Waters AccQTag 氨基酸測定方法包（美國 Waters 公司）：包括Waters AccQFluorTM專利氨基酸專用衍生劑、Waters AccQTag氨基酸分析柱（Nova-PakTMC18柱）、玻璃衍生管、濃度為2.5mM（胱氨酸例外，為1.25

6、mM）的18種氨基酸混合標準液、預混合好的流動相A濃緩沖液；乙腈（色譜級）；6M 鹽酸溶液。2.3 試驗方法2.3.1色譜條件AccQTag 氨基酸分析專用柱：AccQTagTM（3.9150mm），柱溫 37；檢測波長254nm；流速：1.0ml/min；流動相A：AccQTag氨基酸分析方法包緩沖鹽溶液；流動相B：乙腈（色譜級）；流動相C：高純水。梯度洗脫程序見表1。表1 梯度洗脫程序表Tab. 1 Gradient Table時間流動相A%流動相B%流動相C%曲線0.000.5018.0019.0029.5033.0036.0060.0070.00100.099.095.091.083.

7、00.0100.00.00.00.01.05.09.017.060.00.060.060.00.00.00.00.00.040.00.040.040.0*1166611111162.3.2標準液準備移取氨基酸標準液10l加90l Milli-Q水稀釋，按AccQTag制備外標法配成標準液10。2.3.3 樣品處理游離氨基酸樣品：分別取Prima和自制蛋白餌劑1.0ml置于2.0ml離心試管中，離心10min（13000r/min），用0.45m濾膜過濾，備用。多肽氨基酸樣品：取5倍稀釋的Prima和自制蛋白餌劑0.5ml，加入1.0ml 6mol/L鹽酸-0.5%苯酚溶液于3.0ml安瓿管中，

8、充入氮氣11,12，密封，置于110條件下水解24h，取出冷卻后離心10min（13000r/min），取10L上清液用Milli-Q水稀釋100倍，用0.45m膜過濾，備用。2.3.4 衍生方法三種樣品液除了所取樣品液體積和加入緩沖溶液體積不同，衍生方法相同，應合并簡化標準液的衍生：移取10L 已配制好的含有18 種氨基酸標準溶液加入6 mm50 mm的樣品管底部，加入70L硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混合10 s后，邊混合邊加入20L衍生試劑溶液到樣品管中，密封樣品管，室溫放置1 min，于55加熱10 min，取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至微量自動進樣瓶中，進樣分析10,13。游離氨基酸樣品液的衍生：分

9、別取經(jīng)過處理的Prima和自制蛋白餌劑樣品液10l，放入6 mm50 mm樣品管底部，加入70L硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混合10 s后，邊混合邊加入20L衍生試劑溶液到樣品管中，密封樣品管，室溫放置1 min，于55加熱10 min，取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至微量自動進樣瓶中，進樣分析10,13。多肽氨基酸樣品液的衍生：分別取Prima和自制蛋白餌劑多肽氨基酸樣品液取20l，放入6 mm50 mm樣品管底部，加入60L硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混合10 s后，邊混合邊加入20L衍生試劑溶液到樣品管中，密封樣品管，室溫放置1 min，于55加熱10 min，取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至微量自動進樣瓶中，進樣分析10

10、,13。3 結(jié)果與分析3.1 18種氨基酸標準品分析采用2.2.1的色譜條件，通過高效液相色譜儀測得18種氨基酸標準品的色譜圖如圖1。由圖1可以看出，18種氨基酸經(jīng)衍生后，在2.2.1的色譜條件下得到了很好的分離。幾種比較難分離的氨基酸對，His/NH3、Arg/Thr均可獲得較好分離效果。圖1 18種氨基酸標準品混合溶液的色譜圖為什么Asp的峰為紅色？是采用手動積分了么？Fig. 1 Chromatogram of 18 amino acid standards3.2 樣品中氨基酸的分析通過高效液相色譜儀測得Prima和自制蛋白餌劑中游離氨基酸和多肽氨基酸的種類，結(jié)果見圖2和圖3。結(jié)果表明，

11、兩種蛋白餌劑中氨基酸經(jīng)過衍生后在2.2.1的色譜條件下分離效果較好，較難分離的氨基酸對，也可獲得較好的分離效果。從譜圖中可以看出兩種產(chǎn)品均包含17種游離氨基酸、18種多肽氨基酸，胱氨酸為水解后得到的氨基酸，。CBAA. 標準品 B. Prima C. 自制蛋白餌劑圖2橘小實蠅蛋白餌劑游離氨基酸色譜圖Fig. 2 Chromatogram of free amino acid contentCBAA. 標準品 B. Prima C. 自制蛋白餌劑圖3多肽水解氨基酸測定結(jié)果色譜圖Fig. 3 Chromatogram of polypeptide amino acid content 3.3 樣品

12、中氨基酸及多肽的含量通過外標一點法計算得出Prima和自制蛋白餌劑中18種氨基酸的含量，總氨基酸與游離氨基酸的差值則為多肽的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：Prima中總氨基酸含量為5284.76 mg/100ml，游離氨基酸總含量為573.64 mg/100ml，占總氨基酸的10.85%，其多肽含量為4711.12 mg/100ml，占總氨基酸的89.15%。本課題組自制橘小實蠅蛋白餌劑游離氨基酸總含量為630.10mg/100ml，占總氨基酸的9.60%，多肽氨基酸含量為6562.43mg/100ml，多肽含量為5932.33 mg/100ml，占總氨基酸的90.40%。Prima中游離氨基酸

13、 Leu和Phe含量較多，分別為55.68 mg/100ml 和53.81 mg/100ml，His和Met兩種含量較少，均未超過15.00 mg/100ml，Cys含量最少為0 mg/100ml；總氨基酸Glu含量最多，達723.18 mg/100ml，增加最多，其他氨基酸均不超過450.00 mg/100ml，但是水解后的樣品中存在Cys，含量最少，為12.14 mg/100ml。本課題組自制橘小實蠅蛋白餌劑游離氨基酸 Glu和Ala含量較多，分別為73.46 mg/100ml 和79.12 mg/100ml，His和Met兩種含量較少，均未超過15.00 mg/100ml，Cys含量最少

14、為0 mg/100ml。總氨基酸中Glu含量最多，達975.46 mg/100ml，其次是Asp，為616.22 mg/100ml，其他氨基酸均不超過500.00 mg/100ml，水解后的樣品中Cys含量最少，為11.82 mg/100ml。以上數(shù)據(jù)說明兩種蛋白餌劑中的氨基酸主要以多肽形式存在，而不是以游離氨基酸形式存在。所有游離氨基酸中Ser、Gly、Pro、Tyr、Val、Met、Lys、Ile幾種氨基酸在兩種產(chǎn)品中含量相當，而總氨基酸中Gly、NH3、Pro、Tyr、Met、Phe含量相當。表2 蛋白餌劑中游離氨基酸和多肽氨基酸含量對比Tab. 2 Content of free am

15、ino acid and polypeptide amino acid of protein bait 氨基酸名稱游離氨基酸mg/100ml總氨基酸mg/100mlPrima橘小實蠅蛋白餌劑Prima橘小實蠅蛋白餌劑AspSerGluGlyHisNH3ArgThrAlaProCysTyrValMetLysIleLeuPhe合計34.5833.4941.4923.0913.0915.2143.2229.8355.7147.93033.6837.8812.8718.8223.2655.6853.81573.6447.2333.0273.4625.0614.8016.0557.2120.7879.1

16、245.06035.3936.7611.1219.5923.8546.4145.69630.10442.05305.42723.18309.73133.36100.88275.23293.58390.00388.8312.14226.94360.0590.52305.12260.00396.35271.385284.76616.22379.02975.46360.24161.25122.18381.98359.73484.77332.8311.82264.69420.55112.57454.07326.91493.15304.996562.434 結(jié)論本文采用柱前衍生高效液相色譜法（AccQT

17、ag法）對馬來西亞Pupuk Alam 公司生產(chǎn)的Prima蛋白餌劑和本課題組自制的橘小實蠅蛋白餌劑兩種產(chǎn)品中氨基酸種類及含量進行了比較，結(jié)果表明兩種蛋白餌劑中均含有17種游離氨基酸，18種多肽氨基酸。Prima蛋白餌劑中游離氨基酸總含量為573.64 mg/100ml，多肽氨基酸含量為5284.76 mg/100ml，多肽含量為4711.12 mg/100ml，本課題組自制蛋白餌劑中游離氨基酸總含量為630.10mg/100ml，多肽氨基酸含量為6562.43mg/100ml，多肽含量為5932.33 mg/100ml。References1 Zhuang Jianlong(莊劍隆),Fuj

18、ian Agricultural. (福建農(nóng)業(yè)),2006,(9):22.2 Huang Suqing(黃素青),Han Richou(韓日疇). Entomological Knowledge. (昆蟲知識),2005,42(5):479-484.3 Steiner L F. Fruit fly control in Hawaii with poison bait sprays containing protein hydrolysates J.J Econ Entomol,1952,45:838-843.4 Smith E S C. Fruit fly control by protein

19、 bait applicationJ. Agnote, 1998,7:1-4.5 James D B, Sridhar P. Feeding and survivorship of blueberry Maggot flies (Diptera: Tephritidae) on protein baits incorporated with insecticides J. Florida Entomologist , 2005, 88 (3):268-279.6 Zou Huajiao(鄒華嬌). China Plant Protection. (中國植保導刊),2005,(8):35-36.

20、7 Wang Meilan(王美蘭),Luo Yingpeng(羅映鵬). Guangdong Agricultural Sciences.(廣東農(nóng)業(yè)科學),2008,9: 80,85.8 Wang Bo (王波), Huang Juchang (黃居昌), Ji Qinge (季清娥), Yang Jianquan (楊建全), Chen Jiahua (陳家驊).Journal Of Jiangxi Agricultural University. (江西農(nóng)業(yè)大學學報),2010,32(2):0299-0302.9 Zhao Xianen(趙先恩), You Jinmao (尤進茂),Li

21、u Hongzhen(劉洪珍),Suo Yourui(索有瑞). Chinese J. Anal. Chem. (分析化學), 2007,35(7):938-944.10 Waters AccQTag Chemistry Package Instruction Manual.11 Rutherfurd SM, Gilani GS. Amino acid analysis.Curr protoc Protein Sci, 2009,58:11.12 Fountoulakis M, Lahm HW. Hydrolysis and amino acid composition analysis of

22、 proteins. J Chromatogr A,1998,826:109.13 Miao Hong(苗 虹),Yang Tao(楊濤),Huo Junsheng(霍君生), Liu Qicheng(劉期成),Lu Chengqian(盧承前),Chinese J. Anal. Chem. (分析化學), 2000,28(9):1091-1095.Analysis of Amino Acids in Protein Bait for Bactrocera dorsalis ( Hendel) by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn DerivatizationAbstract: High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization was used to an