血紅蛋白的提取和分離

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)思考1 高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考2 人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人 的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。 在紅細(xì)胞的組成中，約90%是血紅蛋白。它由四個(gè)肽鏈組成，包括兩個(gè)肽鏈和兩個(gè)肽鏈。每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色。（四）血紅蛋白二 實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理血液血漿水

2、分固體物質(zhì)血漿蛋白無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（ ）兩個(gè)a肽鏈兩個(gè)一肽鏈樣品處理粗分離純化純度鑒定共四條肽鏈90（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析： 裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。紅細(xì)胞的洗滌分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑 無色透明的甲苯層脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅細(xì)胞

3、破碎物沉淀 暗紅色沉淀物（二） 凝膠色譜法-純化血紅蛋白 1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩） 2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動(dòng)，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過程相對(duì)分子質(zhì)量較小較長較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快2.凝膠色譜

4、操作:（1）凝膠色譜柱的制作： 取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管 底塞的制作 頂塞的制作 組裝 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 （2）凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇： 材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠 凝膠的前處理 計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填 注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。50cm高洗脫血紅蛋白 1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗

5、外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液： 2、作用： 能夠抵制（ ）的對(duì)溶液的（ ）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值 3、緩沖溶液的配制 通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。12使用比例在不同PH范圍內(nèi) 思考：說出人體血液中緩沖液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3（三） 電泳-鑒定血紅蛋白1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。 在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保

6、證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色） 2、原理：許多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，這些基團(tuán)會(huì)帶上（ ） 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（ ） 移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團(tuán)正電或負(fù)電所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度一定的PH常用-聚丙稀酰胺凝膠電泳測(cè)定（ ）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量

7、。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于( )。分子的大小答:血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括:樣品處理,粗分離,純化和純度鑒定. 通過洗滌紅細(xì)胞,血紅蛋白的釋放,收集血紅蛋白溶液-樣品的處理; 經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)-樣品的粗分離; 通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去-樣品的純化; 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)純度鑒定.答:血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液.這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作.4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D 二者根本無法比較3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A 電荷的多少 B 分子的大小C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A 調(diào)節(jié)pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C 防