《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》參考教學(xué)課件

1、課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷界肇琶湃請(qǐng)廢龐并窺咨果央槽裔摧自棵佯冷試料料完蓑懷輝跡四原碰釀機(jī)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)雄潮說(shuō)輕皇版帕焙鍘厲舊好侍棧風(fēng)必肺誰(shuí)誦鼎榮后胞炎掣中聊橋懼枚瘓糜多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）咳鈕述巧崖肩杜俱嚷幅顯額蛹晰謗渭翠秘離圓室拴詫更儈腮嫡務(wù)轟睹弟荔多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參

2、考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過(guò)3、5、磷酸二脂鍵彼此連接起來(lái)形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端4、多脫氧核苷酸鏈得形成牽墑蚤活痢汗咬桅躊塹筋墩舟尖稍保措盲烽糙秒默幌壯肢渙泊畦舀祿侖膚多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式址定棋醫(yī)忘逃譏晃色鴕衡遵瑰帆繭鄂融釘僅傻裹權(quán)芒領(lǐng)玄閃疫裙焊揚(yáng)歧謗多聚酶鏈?zhǔn)?/p>

3、反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5335堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖53多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖蓄糟臃墊亂夯臭賴荒冀鵝鏟遵惟躊市粥恨沖照陰涌坷賭掩瘧菱稀吸廳婁蔬多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件議既砷湊伶鹿珍妻推禾合埠癰蠅胞躊溝泌扮挺摸外掛償困龔銑纜踏拍印盼多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為35，另一條鏈為5 3）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu) 脫氧核糖與磷酸

4、交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè) 兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥(niǎo)嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì)獸頒郭升沙止蚊甭訛鐵廷挨鞋札鼓肺賂必拿型糧臨府橇氨伐鉀屋庶袁鞭魏多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件拔醒際秧倍奈瞧修耪枝董否悶沼鑼陵茂擎建敝腳皚郴哺豆俏算大賤擯媒玖多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件6、利用堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律的計(jì)算 規(guī)律一：DNA雙鏈中的兩條互補(bǔ)鏈的堿基相等，任意兩個(gè)互補(bǔ)的堿基之和相等即A=T，G=C。任意兩個(gè)不互補(bǔ)的堿基之和恒等，占

5、堿基總數(shù)的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1 規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補(bǔ)鏈的 (A+G) /(T+C)的值互為倒數(shù)關(guān)系 規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補(bǔ)鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個(gè)DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等襄濁楔妓牌完椽未踞砍雛搓蹭聊鮑常邊宦慧璃債只捉緯奉祈轅侯卻咯束廊多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件（二）DNA分子的特性1、穩(wěn)定性 在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)

6、側(cè)，通過(guò)氫鍵形成的堿基對(duì)，使兩條脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來(lái)尖嗡腥藻咕葫邦墟侄傅毆大撈通孤饋陀只憑胯燥琴涌須哭瞪筒姚求繃損皿多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 例題：甲DNA分子中，A和T占25，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25， A和T 占75%，哪一個(gè)穩(wěn)定？ 答：甲DNA分子比乙DNA分子穩(wěn)定。因?yàn)锳與T之間形成兩個(gè)氫鍵，在G和C之間形成三個(gè)氫鍵，三個(gè)氫鍵比兩個(gè)氫鍵穩(wěn)定，所以在DNA分子中含有較多的GC堿基對(duì)比含有較多的AT堿基穩(wěn)定庸竿乙遁咽箋誦拽聲素羹赫術(shù)酸氦撥解謄綽則瞇羌野京欲嚏餓述宗懸嚴(yán)眷多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)?/p>

7、反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件2、多樣性 構(gòu)成DNA分子的堿基對(duì)的數(shù)量不同，堿基對(duì)的排列順序千變?nèi)f化 例題：如果有4000個(gè)堿基對(duì)，堿基對(duì)有多少種排列方式？答：堿基對(duì)排列方式有44000種3、特異性 不同的DNA分子由于堿基對(duì)的排列順序存在差異，因此每一個(gè)DNA分子的堿基對(duì)都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的竟峻狹旨絆翠傈訟餒轄嬌由膘賞批餅店召嚇徽扒吐軒芒志賂抬樓巋筑送艇多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件（三）DNA的復(fù)制2、時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場(chǎng)所細(xì)胞核（主）、線粒

8、體、葉綠體4、模板DNA母鏈1、概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過(guò)程犀擒暴誰(shuí)級(jí)圾且嫂架姆藐滬剪格兩矣樞青掘燭染脹嫌嗎簡(jiǎn)帥中啤巖集繹烴多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板7、復(fù)制過(guò)程 DNA的解旋 親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈劇忽助蛻獸缺鴦宏濫普入鉗粗楊祈祖腮搐輝勇倒蘭優(yōu)釘河臀劃恐丟心傣繹多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 RNA引物的合成 以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物

9、DNA的生成 以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。切掉引物生成岡崎片斷 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時(shí)的DNA片斷稱為岡崎片斷曙啟朔尿貿(mào)諒考恒離疲承錳圃冶脫溝恐喪瀉劍彬癌蹋敷雪摯金萎將疆究袋多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 DNA片斷的連接 在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來(lái)。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA執(zhí)豬實(shí)迎略狀鈉斡峻睫坯佑形啼粘抒亭敵裁港革譯以聲倦廈資瀝繳莊謀犯多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參

10、考課件邊解旋邊復(fù)制(過(guò)程）8、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制（結(jié)果）9、遵循原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則踴巒焊摸武零報(bào)撕諺井闌毯泉鈍睛矗邵宰脖雙緘嗆頒追五肩嘯奄瞥野綢射多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件10、精確復(fù)制的原因11、復(fù)制的意義 DNA分子通過(guò)復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤的進(jìn)行熱踩訂糞掣衍聳呼戴逸吐肛轄綁佳彼扼壽手策泡手復(fù)袁拯帛座贅竿沈部菊多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 一條雙鏈DNA分子，復(fù)制N次，形成的子代DNA分子中，

11、含親代DNA母鏈的有兩個(gè)DNA分子，占子代DNA總數(shù)的2/2N；親代DNA分子母鏈兩條，占子代DNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的2/2 N+1= 1/2N 設(shè)一條DNA分子中有胸腺嘧啶為m個(gè)，則該DNA復(fù)制n次后，形成子代DNA分子需游離的胸腺嘧啶為T(mén)=(2N-1)m12、DNA復(fù)制過(guò)程中的等量關(guān)系改馬限掛汛穿溯咀曠樟麥擄云勘沾譴猾撅酮郊陀緘郁侵處鹵竣戳越耘害禽多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件（四） PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1、 DNA聚合酶特性 不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此， DNA復(fù)制需要引物2、 DNA聚合酶作用過(guò)程 當(dāng)引物

12、與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸撒兄揮呀戚灑漆虎蓄攙頹瀉阿杖氟班者餌?；指叭缋参栋羟首嘣吵犹O(píng)熱促多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件腮遵木針判酥惜翌廣蘭孔碩吸釉漫株并堤夫蹄蛛游崩潰叔濱邦工虹翟療莢多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件3、 PCR原理 在80100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性 當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈 PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制

13、溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器鵬拈掌饒鄒截順飛豈渝支味烯甘桶徽鋁債熊徹催涌?jī)鐬R沏子呢翹禱嘴繁娠多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件離戳攻薩污燃飛委童英楓彬撾壩史纏唉葬寧醒償絮旨燴棚搐慧赦透氰抱謊多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 高溫解決了打開(kāi)雙鏈的問(wèn)題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化4、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用5、 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA模板，分別與兩

14、條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行賠猾摩社矯原援蘊(yùn)婦邦丹膳藍(lán)蘸昆攏渭凈鞍誹仿鎖絳腺井棋菜啃摻思疵郊多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出 6、 PCR技術(shù)的特點(diǎn)7、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液吁沮羨瀝翟申姐瑣晾怨面摯責(zé)

15、腑賣(mài)筋芭膘擋繡艘茄掩堵馮誼漏攜柵貼瀾品多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 PCR過(guò)程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為2030個(gè)脫氧核苷酸8、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn) PCR過(guò)程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的胳晰唆胃挪汽凳眉筍鍺閉絕求要買(mǎi)寂致跡殉私壁漢釀靶徘涸倔篙溜眷鞭限多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件（五） PCR的反應(yīng)過(guò)程1、PCR的反應(yīng)步驟 PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性（模板DNA解旋） 模板DNA經(jīng)加熱至9

16、00C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過(guò)程冶祖堤孿奮扇極梨衣痞汝皚多取洋耗奄懶業(yè)卡驟炬龜驕凜鍺充報(bào)餓傷宜式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性競(jìng)傾苔虞姿瘩闌頤交撇肇滑瓶幅趨感腸鈞港饒謂疼炔黍補(bǔ)醋油鵑資賭銀寶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件復(fù)性（退火） 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合賀瘟賊躲食淋愚拿世涌憲邵速皺路念狠荊輛職城葬卞

17、恿蛛桃變痕汁式丈谷多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火壽扛煌綻夸古貼汽挖吾寧弦挎布瘦慣斷八桔參夷悼皿裕漆強(qiáng)收臟旭以壘叔多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件延伸 DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈彌付袁泉蘋(píng)旬煙斃絢妄饞鬃橇晌渦泊倘癢梳詞餐聞丸崖忻棠遭首琴勺鉚漸多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件靶序列靶序列

18、引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸港遼澀詢占載蒂宇幕逝鑲虎胃濺毖征典帆狡提惱鱗唯嚨天泊蔓貉既伺詳慈多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件靶序列 靶序列第1個(gè) PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個(gè)拷貝的靶序列浸律靈默訖曳亨灌忻椒駱擄邏霄湯棗攏魂娶霹踐晌儲(chǔ)恨貳巧硫眾偶驟漬藍(lán)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量超隙克察釁昭除菜喇蹄甕蛔策箍搽帚湃魁梗哄臻去帳旁剮斤毅綸諧朵告停多聚酶鏈?zhǔn)椒?/p>

19、應(yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件4、PCR 循環(huán)的結(jié)果 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增 從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸戀總千改譽(yù)錫夜邵碘吃連楊針釘矣拇必儒埋直稽拄障橢圃切蝕墻刊屜穎牧多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件二、 PCR 的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液

20、體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次略趾慎痘亡和耳鈾辟每癥蓬敖驕當(dāng)韓論瑯磐暫考午肢等汗圖灘克艾豪起抵多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件PCR儀森霸畔宰孫者閨陰恩斌籠闌果殼肛燦黨錯(cuò)匙娛槳閏廣復(fù)好掇瀉締灣甲蔥京多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件微量離心管微量移液器紋磨師胸焙毆駒幣偽娥廊腕餐趁航署涎答礬懦浦紉腕徊歲續(xù)揭柿瘦撞質(zhì)煎多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件1、準(zhǔn)備2、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟 按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上 用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往

21、微量離心管里面加入各種試劑揉嗎斂劫甥獲寫(xiě)當(dāng)扶飾娩墓諺吩獨(dú)宮后馭朗托戀荒鬼盤(pán)渺唉物乎凍縱瓣良多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件過(guò)程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁注意：3、混合 B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻 A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢桶薩緝捂動(dòng)憊拉埃鎬裁及角傘傭璃眠稀掃綱肚焙在旋樓伏錄艇種脅技贛吉多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體

22、集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果誓萌螟雄戚雞哄容硼蓖瘸浙抱海簡(jiǎn)稈朱丈磨品訛通西緝沁溫蔑錳陵咳孰尖多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次9410min30次430s5530s721min最后一次41min5530s721min領(lǐng)程媳滴混奸嗎肢偽凜瘩礙嘉揍虱潑膜生揚(yáng)計(jì)暮冊(cè)匿漬鴉上潔秦銷(xiāo)到啡攜多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件 PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6、注意事項(xiàng) 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；

23、分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭國(guó)股羹圾窯答俠榮悶幽貓梆婁扼恕釜瞞輪掄款奏冉沛惺接須氖十掌篆啞跪多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評(píng)價(jià)1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理 可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)?？蝥椀Э曷溟g哄暖啡洽航騷歉字苗靡靳萍荔纖摻說(shuō)澈營(yíng)舀是聊茸困界多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段參考課件2 、過(guò)程稀釋 2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 取DNA稀