毛細管電泳與毛細管電色譜

1、關于毛細管電泳和毛細管電色譜第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 毛細管電泳（capillary electrophoresis;CE）是一類以高壓直流電場為驅動力，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術。 毛細管電泳是分析科學中繼高效液相色譜之后的又一重大進展，它使分析科學從微升水平得以進入納升水平，并使單細胞分析成為可能。 毛細管電色譜（capillary electrochromatography; CEC）是毛細管電泳與液相色譜相結合形成的一種高效、快速微分離分析技術。 第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1

2、毛細管電泳和毛細管電色譜的基本理論3.1.1 雙電層和Zeta電勢第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.2 電泳 在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。陰離子向正極方向遷移，陽離子向負極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運動。 在充滿自由溶液開口管中球形粒子的電泳速率公式為： 電泳淌度（ep)定義為單位場強下離子的平均電泳速率，即第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.3 電滲流 電滲是毛細管中整體溶劑或介質在軸向直流電場作用下發(fā)生的定向遷移或流動。 電滲的產(chǎn)生和雙電層有關，當在毛細管兩端施加高壓

3、電場時，雙電層中溶劑化的陽離子向陰極運動，通過碰撞作用帶動溶劑分子一起向陰極移動，形成電滲流(EOF)。 度量電滲流大小是單位電場下的電滲流速率即電滲淌度(eo)或電滲速率(ueo)，可用Smoluchowski 方程表示： 第五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.3 電滲流 以電場力驅動產(chǎn)生的溶液EOF，與高效液相色譜中由高壓泵產(chǎn)生的液體流型不同： 電滲是CE的基本現(xiàn)象之一，它可以控制組分的遷移速率和方向，進而影響CE的分離效率和重現(xiàn)性，所以電滲流控制是CE中的關鍵問題或技術之一。第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.4. 電滲流的控制影響電滲流的因素很多，直接

4、影響因素有：1. 電場強度 2. 溫度 3. pH值 4. 緩沖液溶劑 5. 離子強度 6. 添加劑 7. 管壁涂層 第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.5. 分離原理 電泳和電滲流并存，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細管內(nèi)電介質中的遷移速率是兩種速率的矢量和： 令app=ep + eo，稱之為表觀淌度，即從毛細管電泳測量中得到的淌度為粒子自身的電泳淌度和由電滲引起的淌度之和，并有 在典型的毛細管電泳分離中，溶質的分離基于溶質間電泳速率的差異。電滲流的速率絕對值一般大于粒子的電泳速率，并有效地成為毛細管電泳的驅動力。溶質從毛細管的正極端進樣，帶正電的粒子最先流出，中性粒子

5、次之，帶負電的粒子在中性粒子之后流出。溶質依次通過檢測器，得到與色譜圖極為相似的電泳分離圖譜。 第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.5. 分離原理 毛細管電色譜由于引入了色譜機制，其保留機理包括兩個方面: 其一，如同HPLC，基于溶質在固定相和流動間分配過程； 其二，如同CE，基于溶質電遷移過程。CEC容量因子可用下式表示： 由于CEC既能分離電中性溶質，又能分離帶電溶質，對復雜的混合樣品顯示出強大的分離潛力。 第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.6. 柱效和分離度 與色譜相同，CE和CEC的柱效一般也用塔板數(shù)N或塔板高度H來表示。實際應用中，可根據(jù)以下公式

6、計算： 從理論上分析，CE分離的柱效可表示為 D為擴散系數(shù)，樣品相對分子質量越大，擴散系數(shù)越小，柱效越高，所以毛細管電泳比色譜更適合于生物大分子分離分析。 第十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1.6. 柱效和分離度 類似于HPLC，CEC的柱效可用vanDeemter方程表征： 作為一種重要的分離分析手段，CE和CEC仍沿用分離度R作為衡量分離程度的指標，并定義如下： 第十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2. 毛細管電泳和電色譜儀器裝置 21.2.1.儀器基本結構1 高壓電源；2 毛細管；3 檢測器；4 電極；5 緩沖液瓶；6 恒溫系統(tǒng)；7 記錄儀 第十二張，PP

7、T共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.2. 進樣系統(tǒng) 毛細管分離通道十分細小，整個柱體積一般只有45L，所需的樣品區(qū)帶只有幾納升。 毛細管電泳的進樣方式一般是將毛細管的一端從緩沖液移出，放入試樣瓶中，使毛細管直接與樣品接觸，然后由重力、電場力或其他動力來驅動樣品流入管中。進樣量可以通過控制驅動力的大小或時間長短來控制。CE進樣技術均適用于CEC。 目前有三種方法可以讓樣品直接進入毛細管： 電動法、壓力法和濃差擴散法。 第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.3. 電源及其回路 電流回路系統(tǒng)包括高壓電源、電極、電極槽、導線和電解質緩沖溶液等。CE和CEC一般采用0 30 kV

8、連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源。理想的電源應具備： 1.能輸出單極直流高壓(一端接地)； 2.電壓、電流、功率輸出模式任意可選； 3.能控制電壓、電流或電功率的梯度； 4.電壓輸出精度應高于1%。 CE的電極通常由直徑0.5l mm的鉑絲制成。 電極槽，即緩沖液瓶，通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(15mL不等)，要便于密封。緩沖液內(nèi)含電解質，充于電極槽和毛細管中，通過電極、導線與電源連通，一同構成整個電流回路。第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.4. 毛細管及其溫度控制 熔融石英毛細管在CE中應用最廣泛，熔融石英拉制得到的毛細管很脆，易折斷，一般在外表面涂有聚酰亞胺保護層，使之變得

9、富有彈性，不易折斷。 內(nèi)徑越小，表面積/體積比越大，散熱效果越好。內(nèi)徑小，樣品負載小，檢測、進樣、清洗等操作困難。 一般使用的毛細管柱內(nèi)徑在25 100 m之間，目前最常用的是50m和75m兩種。 檢測窗口部位的外涂層剝離。 焦耳熱效應產(chǎn)生徑向溫度梯度，還會導致分離重現(xiàn)性差。商品儀器大多有溫度控制系統(tǒng)，主要采用風冷和液冷兩種方式。 一般采用物理吸附或化學鍵合兩種方式形成毛細管內(nèi)壁涂層，對石英毛細管進行改性或修飾，可有效控制電滲流、抑制吸附進而優(yōu)化分離。 第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.5. 檢測系統(tǒng)第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.5. 檢測系統(tǒng)第

10、十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3. 毛細管電泳分離模式及應用3.3.1. 毛細管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis; CZE）3.3.1.1. 基本操作條件 毛細管區(qū)帶電泳也稱為毛細管自由溶液區(qū)帶電泳，是毛細管電泳最基本、也是應用最廣的一種操作模式。其分離原理是基于樣品組分荷質比的差異。 需要控制的操作變量主要是電壓、緩沖液濃度、pH值和添加劑等。 緩沖液的選擇通常須遵循下述要求： 1在所選擇的pH范圍內(nèi)有合適的緩沖容量。 2本底檢測響應低。 3自身的淌度低，即離子大而荷電小。第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.1.

11、毛細管區(qū)帶電泳（CZE） 在CZE分離中，除了背景電解質外，常常還在緩沖溶液中加入某些添加劑： 1.中性鹽 2. 表面活性劑 3. 手性添加劑 對于許多水難溶的樣品，如果在緩沖液中加入少量的有機溶劑，常常能有效改善分離度。在極端情況下，可完全使用有機溶劑，或以有機溶劑為主體，這就是非水毛細管電泳技術。圖21-6 電滲流反向示意圖 第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.1. 毛細管區(qū)帶電泳（CZE）3.3.1.2. 應用毛細管區(qū)帶電泳特別適合分離帶電化合物，包括無機陰離子、無機陽離子、有機酸、胺類化合物、氨基酸、蛋白質等，不能分離中性化合物。 毛細管區(qū)帶電泳3分鐘內(nèi)分離30種陰

12、離子電泳圖 第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.2. 膠束電動毛細管色譜（MEKC） MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑分子之間的疏水基團聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準固定相，溶質基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。第二十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.2. 膠束電動毛細管色譜（MEKC） MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當溶液中表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑分子之間的疏水基團聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準固定相，溶質基于在水相和膠束相之間的分配系

13、數(shù)不同而得到分離。 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動； 可用來分離中性物質 色譜與電泳分離模式的結合。第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.3. 毛細管凝膠電泳（CGE） 毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis;CGE)是在毛細管中充填多孔凝膠作為支持介質進行電泳，其分離是基于篩分機理。 CGE常用于蛋白質，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分離和測定。 凝膠是毛細管電泳的理想介質，粘度大，抗對流，能減少溶質的擴散，因此能限制譜帶的展寬，所得的峰型尖銳，柱效高，有可能使組分在短柱上實現(xiàn)極好的分離。

14、常用的凝膠有聚丙烯酰胺和瓊脂糖，應用最多的是前者。第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.4. 毛細管等電聚焦（CIFF） 1. 根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術； 2. 毛細管內(nèi)充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.4. 毛細管等電聚焦（CIFF） 1. 根據(jù)等電點差別分離生

15、物大分子的高分辨率電泳技術； 2. 毛細管內(nèi)充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零； 4. 聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離。第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.4. 毛細管等電聚焦（CIFF） 1. 根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；

16、2. 毛細管內(nèi)充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零； 4. 聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離。第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3.5. 毛細管等速電泳（CITP） 1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌

17、度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。 2. 負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。 3. 不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(=E)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度?。?沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4 電場強度依次增大。假設“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊； 4. 特點：界面明顯，富集、濃縮作用；第二十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4. 毛細管電色譜柱技術

18、毛細管電色譜（CEC）是毛細管電泳與高效液相色譜的有機結合，其基本理論、儀器裝置與毛細管電泳大致類似。 最大的不同是毛細管柱引入了色譜固定相，使CEC同時具有CE與HPLC的分離機理，對中性物質和荷電物質都能達到理想的分離效果。 因此毛細管柱是CEC的心臟，制柱技術是CEC的關鍵。按照固定相不同形式，CEC可分為填充柱、開管柱和整體柱（連續(xù)床）。第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱 填充柱在CEC中應用最廣泛，其最大優(yōu)點是可以利用眾多的HPLC固定相，根據(jù)化合物與固定相作用不同實現(xiàn)高效分離。1 入口柱塞; 2 填充部分; 3 出口柱塞; 4 檢測窗口; 5 開

19、管部分第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱3.4.1.1. 柱塞制作 柱塞的制作對于填充柱非常關鍵。合格的柱塞必須滿足如下要求： 有足夠的機械強度,能夠承受填充時的高壓； 化學惰性，耐有機溶劑和寬pH值的緩沖液； 有合適的孔隙率，既不使流動相受阻，又可防止固定相顆粒通過； 死體積小，避免電色譜峰展寬。 柱塞制作方法很多，目前應用較多的有水玻璃燒制法和填料直接燒制法。第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱3.4.1.2. 填充柱制備高壓勻漿填充法電動填充法第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱3.4.

20、1.3. CEC填充固定相 在成功掌握填充柱制備技術條件下，CEC固定相是影響毛細管填充柱分離選擇性、柱效、分離速度的重要因素，也是發(fā)展新型CEC分離模式的基礎。 應用于HPLC的各種固定相已被應用于CEC的分離分析中，其中以十八烷基鍵合硅膠固定相(ODS)研究最多，由于CEC是以電驅動流動相，不存在柱壓降問題，因而可以采用粒徑很小的固定相，以提高柱效。 混合官能團固定相是專門針對CEC研制的新型填料，這一類固定相在硅膠表面同時鍵合具有反相色譜性能的烷基官能團和具有離子交換性質的磺酸官能團，在很寬的pH范圍內(nèi)都能保持良好的電滲流。第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱3.4.1.3. CEC填充固定相第三十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.1. 填充柱3.4.1.4. 氣泡問題 填充柱CEC操作中的困難是在分離過程中常常伴有氣泡產(chǎn)生。氣泡一般產(chǎn)生于柱塞與填料交界處或柱塞與檢測窗口交界處。 控制氣泡的產(chǎn)生，目前主要采取以下措施： 1. 加壓，在兩端同時施加低壓，可較好解決氣泡問題。 2. 制備滲透性好的塞子。 3. 利用阻尼管以消除氣泡，在分流閥處接一阻尼管，當電極處有氣泡產(chǎn)生時，氣泡會經(jīng)分流閥通過阻尼管排出。 4. 利用超聲波使樣品