DB50-T 1244-2022 基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法

1、ICS 65.020.30CCS B 41DB50重慶市地方標(biāo)準(zhǔn)DB 50/T 12442022基于plo 基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR 檢測(cè)方法2022 - 06 - 01 發(fā)布2022 - 09 - 01 實(shí)施重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布DB50/T 12442022DB50/T 12442022目次前言II范圍1規(guī)范性引用文件1術(shù)語(yǔ)和定義1縮略語(yǔ)1原理1試劑材料、儀器設(shè)備2方法步驟2結(jié)果判定4廢棄物處理1附錄 A （資料性） 靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置2附錄 C （規(guī)范性） 化膿隱秘桿菌 plo 基因 PCR 產(chǎn)物電泳判定圖4I附錄 B （規(guī)范性） 試劑的配制3前言本文件按照 G

2、B/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。 本文件由重慶市畜牧科學(xué)院提出。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口并組織實(shí)施。 本文件起草單位：重慶市畜牧科學(xué)院。本文件主要起草人：張素輝、沈克飛、許國(guó)洋、付利芝、徐登峰、朱燕、蔣雨、周俊、陳朝洪、龍 小飛、馮剛、鄧小龍、劉博。II基于 plo 基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR 檢測(cè)方法范圍本文件規(guī)定了基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法的縮略語(yǔ)、原理、試劑材料、儀器設(shè)備、方法步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理等要求。本文件適用于山羊化膿隱

3、秘桿菌病的 PCR 診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB 19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T 541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T 3223動(dòng)物傳染病PCR檢測(cè)技術(shù)確認(rèn)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA 脫氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid）PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase C

4、hain Reaction） PL0 溶血素（Pyolysin）TSA 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar soybean-casein digest agar） TSB 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth soybean-casein digest medium）原理本文件針對(duì)山羊化膿隱秘桿菌的plo基因，設(shè)計(jì)合成特異引物，提取細(xì)菌DNA作為模板，在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀察，可見(jiàn)陽(yáng)性條帶。該檢測(cè)方法，只能從化膿隱秘桿菌基

5、因組DNA中擴(kuò)增出特異條帶。1試劑材料、儀器設(shè)備試劑材料實(shí)驗(yàn)用水均符合 GB/T 6682 二級(jí)水規(guī)定。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純及以下的試劑:化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，編號(hào) ATCC 49698。細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒：商品化試劑盒。無(wú)水乙醇。2Taq PCR MasterMix。核酸染料。DNA 上樣緩沖液。瓊脂糖。DNA 分子量標(biāo)記：DNA Marker 2 000。特異性引物：plo-F：TTGATAACGGTCCACCACGG; plo-R：CACTGCCACGACCTACAAGT。靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置見(jiàn)附錄 A。離心管、透明薄壁 PCR 管（0.2 mL）

6、、醫(yī)用棉簽、解剖器械（手術(shù)刀、剪刀、鑷子）、樣品袋。TSA 固體培養(yǎng)基、TSB 液體培養(yǎng)基、TAE 電泳緩沖液，配制方法見(jiàn)附錄 B。儀器設(shè)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a) 電子天平（感量 0.001 g）。高壓滅菌鍋（溫度范圍：105 135 ，工作壓力：0.35 MPa）。高速離心機(jī)（可控溫至 4、離心速度可達(dá) 12 000r/min 以上）。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（溫控范圍：10 300 ，恒溫波動(dòng)度1 ）。二級(jí)生物安全柜。恒溫培養(yǎng)箱（溫度范圍：5 50 ，溫度均勻度：1 ）。純水儀。組織研磨儀。制冰機(jī)。恒溫水浴鍋（溫度范圍：5 50 ，溫度均勻度：1 ）。u) 4冰箱（溫控范圍：

7、2 8 ）；-20冰箱。PCR 儀。電泳儀（電壓 90 V120 V）。凝膠成像儀。微量移液器（2 L，20 L，200 L，1000 L）及配套吸頭。7 方法步驟7.1 樣品采集與保存采樣原則，按照 NY/T 541 的規(guī)定執(zhí)行。2樣品采集根據(jù)臨床情況，可以采集以下樣品：組織樣：無(wú)菌采集肺臟、淋巴結(jié)病變部位，將其放入密閉的樣品袋內(nèi)，并應(yīng)做好樣品標(biāo)識(shí)。胸腔積液：若有胸腔積液，在完全暴露胸腔前，用 2 mL 或 5 mL 注射器無(wú)菌吸取 1 mL2 mL 胸腔積液,分裝于 1.5 mL 離心管中，并應(yīng)做好樣品標(biāo)識(shí)。膿液：若有肩前或股前淋巴結(jié)腫大、化膿，在膿腫部位表面常規(guī)碘酊消毒，滅菌手術(shù)刀在膿腫

8、下部劃開(kāi)小于 1 cm 創(chuàng)口，擠出膿液，用去掉針頭的 5 mL 注射器吸取膿液,分裝于 1.5 mL 離心管中，并應(yīng)做好標(biāo)識(shí)。樣品保存應(yīng)將采集的樣品于 4 條件下保存，立即送到實(shí)驗(yàn)室。樣品處理實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)符合 GB 19489 要求，在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。組織樣處理取 4g5 g 組織樣，剪碎、研磨，用 5 mL滅菌超純水混懸；2 000r/min 離心 2 min，取上清液；10 000r/min 離心 10 min，棄上清液； d） 沉淀以 200 L 超純水重懸，備用。7.2.3 胸腔積液、膿液處理胸腔積液、膿液等樣品處理方法如下：a） 無(wú)菌吸取 500 L 胸腔積液或膿液至

9、1.5 mL滅菌離心管中，加入 500L 超純水，震蕩混勻； b） 10000r/min 離心 10min，棄上清，收集沉淀；c） 沉淀以 200 L 超純水超純水重懸，備用?？梢膳囵B(yǎng)物樣品處理取待檢液體培養(yǎng)物（純培養(yǎng)物或混合培養(yǎng)物）1 mL 10 000 r/min離心 5 min，棄上清，沉淀以 200 L超純水重懸，備用。陽(yáng)性對(duì)照化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)TSA復(fù)蘇，純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接TSB培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照，處理應(yīng)同 7.2.4。陰性對(duì)照滅菌超純水，處理應(yīng)同 7.2.4。7.3 DNA 提取3肺臟、淋巴結(jié)等組織樣處理方法如下：取第 7.2 獲得樣品，采用同等商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取。PCR

10、擴(kuò)增基本要求PCR檢測(cè)過(guò)程中的敏感性、特異性、重復(fù)性等應(yīng)符合 SN/T 3223 要求。PCR 反應(yīng)體系組成將提取的DNA模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，陰性對(duì)照為超純水，PCR 反應(yīng)體系 20 L，反應(yīng)體系見(jiàn)表 1。表 1PCR 反應(yīng)體系組份體積/L2Taq MasterPCR Mix10 Lplo-F（10 mol/L）0.5 Lplo-R（10 mol/L）0.5 LDNA 模板1 L超純水8 L總體積20 LPCR 反應(yīng)程序94 2min；94 30s，60 30s，72 15s，30 個(gè)循環(huán)；72 3min；4 保存。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，方法操作如下：參照附錄 B

11、制備 50TAE 電泳緩沖液，稀釋為 1TAE 使用；配制含核酸染料的 1.2%瓊脂糖凝膠；取 5 L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與 6DNA上樣緩沖液按體積比 5:1 混合后加入加樣孔；用 1TAE緩沖液作為電泳液，在恒壓 120 V下進(jìn)行電泳；電泳 30 min后將凝膠取出，置于凝膠成像儀中，觀察PCR結(jié)果。8 結(jié)果判定8.1 檢測(cè)結(jié)果成立條件4陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在 264 bp 出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照 PCR 產(chǎn)物電泳后沒(méi)有條帶；檢測(cè)結(jié)果成立。判定圖見(jiàn)附錄 C。結(jié)果描述及判定在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后在 264 bp 的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陽(yáng)性，即

12、該樣品為化膿隱秘桿菌核酸陽(yáng)性。在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后在 264 bp 的位置上未出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為化膿隱秘桿菌核酸陰性。如果陽(yáng)性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測(cè)需要重新進(jìn)行；如果陰性對(duì)照有相應(yīng)的目的條帶，可能是陰性對(duì)照存在污染或是操作失誤，該檢測(cè)需要重新進(jìn)行。9 廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，應(yīng)做好無(wú)害化處理，應(yīng)符合 GB 19489 的要求。1附 錄 A（資料性）靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置化膿隱秘桿菌plo基因DNA片段序列及引物在靶基因中的位置見(jiàn)圖 A.1。圖 A.1 靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置

13、2附 錄 B（規(guī)范性） 試劑的配制TSA 固體培養(yǎng)基（1 L）稱取本品 40.0g 于 1 L 蒸餾水中，微溫溶解，121 高壓滅菌 15min；取出涼至 55，無(wú)菌條件， 按 8%比例加入小牛血清，輕搖混勻后制備平板，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，觀察有無(wú)菌落，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)即可備用。TSB 液體培養(yǎng)基（1 L）稱取本品 30.0 g 于 1 L 蒸餾水中，微溫溶解，121 高壓滅菌 15 min；取出涼至 55 ，無(wú)菌條件， 按 8%比例加入小牛血清，混勻后分裝，備用。TAE 電泳緩沖液（pH 約 8.5）的配制稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris 堿）242g，乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）37.2g，加超純水