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1、epi丈第華西醫(yī)院XFCHINAIIOSFITAI5ICHCANUNIVFRSITY免疫印跡技術(shù)ANA譜測定羅俐梅醫(yī)院Q卩|丈普華XFCHINAIIOSFITAI5ICHCANUNIVFRSITYWesternblot法SDS電泳轉(zhuǎn)移電泳3131條帶印跡法SmSS-BScl-7OPM-SclJo-1nRNP/SmCENPBdsDNSNukleos.Histonerito.P-Prot.AMA-M2KontrolleQP|丈第華西醫(yī)院純化抗原的免疫印跡法純化可提取性細胞核抗原(ENA)包被于硝酸纖維膜上,待測血清標本與之反應(yīng),如存在相應(yīng)抗體,則會結(jié)合上去,并進一步結(jié)合酶標記的二抗,經(jīng)酶底物顯色即
2、可觀察到相應(yīng)的抗體。2卩|丈穆華西醫(yī)院XFSTCHINAIIOSPTTAISICHUANUNIVFRSITY免疫印跡法檢測ENA譜的原理加底物顯色,觀察結(jié)果洗去多余酶標二抗加入酶標二抗反應(yīng)洗去未反應(yīng)蛋白加入標本反應(yīng)純化抗原膜條(膜條試劑盒)nRNP/SmSmSS-ASS-BScl-70Jo-1CENPBdsDNAHistonesliMIIIControl2QP|丈第華西醫(yī)院QP|丈第華西醫(yī)院試劑樣本稀釋液:直接使用工作洗滌液:直接使用(已配好)酶標記二抗:直接使用(已配好)底物:直接使用操作步驟潤膜:取出反應(yīng)槽,每槽加入1.5ml樣本稀釋液,緩慢于室溫孵育5分鐘,將膜條充分潤濕,倒掉樣本緩沖液
3、加樣:然后在每個槽中加入樣本緩沖液1.5mL,并加入待檢血清或質(zhì)控血清15uL,充分混勻,緩慢在室溫振搖孵育30分鐘。洗滌:棄去槽內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,用洗滌液洗滌3次,每次每槽加稀釋洗滌液l5inl,操作步驟加酶:每槽加入稀釋后酶標抗體1.5mL,混勻,緩慢在室溫搖床上孵育30分鐘。洗滌:同前洗滌。顯色:每槽加入顯色液1.5mL,室溫反應(yīng)10分鐘終止:每槽棄去反應(yīng)液,用蒸憾水洗滌三次,取岀膜條,有序貼于結(jié)果分析頁上,待膜條干后進行結(jié)果判斷。XFCHINAIIOSFITAI5ICHCANUNIVFRSITYQP|丈第華西醫(yī)院影響因素未用完的洗滌液棄之,不可留作下次用。全部操作應(yīng)振搖進行,否則
4、檢測敏感性會有所下降。不同血清標本,顯色強度會有不同,弱陽性結(jié)果需仔細觀察。試劑需恢復(fù)至室溫方可使用,否則會影響檢測結(jié)果。QP|丈第華西醫(yī)院QP|丈第華西醫(yī)院試驗準備分為5組,每組取1個病人標本,在一個反應(yīng)板上試驗。其中一組增加陰性和陽性質(zhì)控O各組需領(lǐng)取以下物資:待測標本1份陰性和陽性質(zhì)控1份(第1組)反應(yīng)板和吸水紙樣本緩沖液1瓶樣本洗滌液(已稀釋)1瓶酶標記抗體(已稀釋)共用底物1瓶結(jié)果解釋首先觀察第一條質(zhì)控線應(yīng)顯色才可判讀結(jié)果,若不顯色則說明試劑失效或?qū)嶒炇?需復(fù)查。將膜條上顯色區(qū)帶與抗體位置對應(yīng)抗體帶對照,即可判斷出陽性抗體.抗可提取性核抗原(ENA)抗體抗iiRNP抗體:MCTD95-100%(高滴度)抗Sin抗體:SLE標記性抗體(20%-30%)抗SSA抗體:PSS60-75%,其它CTD抗R052抗體:意義不明抗SSB抗體:PSS10-40%,其它CTD抗Sc
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