脂肪酶酶解奶油制備天然香原料

1、脂肪酶酶解奶油制備天然香原料香精香料被廣泛用于食品添加劑、化妝品、飼料等方面，其需求量也逐年 呈大幅度增加趨勢。根據(jù)BBC Research公司發(fā)布的全球香精香料市場報(bào)告預(yù)測， 2011年將達(dá)78億美元。世界各國所用的香精香料也有差距,美國的食用香料種類 約為2000余種，歐盟的食用香料大約有3000余種，中國批準(zhǔn)使用的食用香料大約 有1500多種。隨著人們生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者要求天然香料的愿望日益增加， 并希望獲得品質(zhì)和性能更好的香料產(chǎn)品。奶味香精是食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的香精之一，酶解乳脂是食品工業(yè)中重 要的一種原料，目前應(yīng)用廣泛且具有很大的應(yīng)用潛力，如作為添加劑應(yīng)用于焙烤 食品（面包、蛋

2、糕、曲奇等）、谷物食品（薄餅）、糖果（巧克力產(chǎn)品、太妃糖）、乳 制品（咖啡伴侶、糖霜、干酪、黃油）以及其他一些產(chǎn)品（調(diào)味品和點(diǎn)心）、乳制品 （發(fā)酵酸奶、調(diào)味奶）等。1天然香料根據(jù)美國聯(lián)邦法典規(guī)定，天然香料指“來源于天然物質(zhì)的芳香油類、浸提 香精油、香料或凈油、蛋白水解物、餾出液以及食品通過烘焙、加熱或酶作用而 產(chǎn)生的含有香料的物質(zhì)，其在食品中的主要功能是調(diào)香而非營養(yǎng)作用。這些天然 物質(zhì)指香辛料、果汁、蔬菜或菜汁、食用酵母、草藥、樹木的根、莖、葉、芽或 類似的植物材料、肉類、海產(chǎn)類、禽蓄、蛋類、奶制品或發(fā)酵產(chǎn)品”。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香料正好可以滿足這些要求，這些制備香精香料的生物方 法大致可分為以下

3、三類：一、生物催化法合成；二、借助微生物細(xì)胞發(fā)酵；三、 通過植物細(xì)胞或者組織提取。生物催化法是指采用生物催化劑，即酶作用于天然物質(zhì)，通過合成或分解 反應(yīng)而獲得天然香料的方法。生物催化法有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，該法生產(chǎn)的香料是 全天然的；其次，采用的催化劑酶可在溫和的反應(yīng)條件常溫、常壓和正常值范圍 下進(jìn)行，且催化效率相當(dāng)高，具有很強(qiáng)的立體專一性和區(qū)域、對應(yīng)體選擇性;第 三，香料生成過程中的副產(chǎn)物少，易于分離純化，而且，即使有副產(chǎn)物，也是天 然無害的；第四，生物催化法能生產(chǎn)品種多樣的香料，幾乎所有的細(xì)胞成分都能 通過分解和合成反應(yīng)產(chǎn)生香料物質(zhì)。生物催化技術(shù)在香精香料應(yīng)用方面，其中脂 肪酶（Lipase）

4、占很大比例。2脂肪酶的催化特性脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，其主要來源是微生物、哺乳動物、 植物。脂肪酶可催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、 轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性。作為一種 被廣泛應(yīng)用的生物催化劑，其在生物、化學(xué)、制藥、食品、香料等各行業(yè)都有重 要應(yīng)用。在香精香料行業(yè)中，生物催化由于具有反應(yīng)條件溫和、高度選擇性、 產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，可以完成很多化學(xué)反應(yīng)不能達(dá)到的效果而被廣泛使用。不同來源的脂肪酶可催化同一反應(yīng)，但在相同反應(yīng)條件下，催化效率不同。 從已知結(jié)構(gòu)的幾種脂肪酶來看，分子量在2000060000之間的脂肪酶作用在體系 的親

5、水-疏水界面層，這是區(qū)別于酯酶的一個特征。脂肪酶的催化部位含有親核 催化三聯(lián)體（Ser - His - Asp）或（Ser- His - Glu）。催化部位被埋在分子中， 表面被相對疏水的氨基酸殘基形成的a螺旋蓋狀結(jié)構(gòu)覆蓋，對三聯(lián)體催化部位起 保護(hù)作用。界面活化現(xiàn)象可提高催化部位附近的疏水性，導(dǎo)致a螺旋再定向，從 而暴露出催化部位；界面的存在，還可以使酶形成不完全的水化層，這有利于疏 水性底物的脂肪族側(cè)鏈折疊到酶分子表面，使酶催化易于進(jìn)行。3酶解機(jī)理乳脂肪的主要成分和脂肪酸甘油三醋（約占55%左右）、不飽和脂肪酸甘油 三醋（約占43%左右）、酮酸甘油三酯（約占1%左右）、羥酸甘油三醋（約占1%

6、 左右），這些脂肪酸甘油三醋在脂肪酶的作用下水解成各種飽和及不飽和脂肪酸， 其中C4、C6、C8、C10、C12、C14含量較豐富，它們具有較高的香氣貢獻(xiàn)度，是 構(gòu)成乳香的主要因素。通常短鏈脂肪酸會產(chǎn)生干酪和奶油的香氣，而長鏈脂肪酸 對風(fēng)味也起著重要的作用。短鏈脂肪酸與長鏈脂肪酸的比例也是影響酶解乳脂風(fēng) 味的重要因素，同時(shí)它也能夠反映出酶解程度，即酶的利用率。B -酮酸在進(jìn)一步 反應(yīng)中又生成各種甲基酮類，主要有甲基戌酮、甲基庚酮、甲基壬酮、甲基十一 酮等等。羥酸生成各種6-內(nèi)酯、Y-內(nèi)酯，其中有6-辛內(nèi)酯、&-內(nèi)酯類、6- 十二內(nèi)酯等偶碳內(nèi)酯。雖然這些甲基酮類和6、y-內(nèi)酯含量不高，但對形成奶

7、 香的貢獻(xiàn)卻很大。其反應(yīng)式為：QHOH 卜 3RCOOHCH.OCOR I(1)C?HOCOR +3HQ型嘩CH.OC：OR脂肪酸甘油二能r水甘油+ 3R8OH脂肪酶(2)火-酮酸甘油三酯 /?-嗣酸.? ?謎一步反應(yīng)：R - C-CH.-CGC.H -R - C - CH,P-酮醒汨基斕類4奶味香原料的制備工藝流程:5影響因素51脂肪酶的篩選脂肪酶簡稱脂酶，它分別來源于動物胰臟與微生物。用微生物的脂肪酶比較 經(jīng)濟(jì)。其中有根霉(Rhigopus)、酵母菌(Yeast)、細(xì)菌(Bacteria)及放線菌 (Actinomyces)產(chǎn)生的脂肪酶。對奶香貢獻(xiàn)較大的為C4C12的脂肪酸，C16以上 的

8、飽和脂肪酸會帶來皂臭味等不良?xì)馕稄亩绊懽罱K的香氣質(zhì)量，應(yīng)盡量減少其 生成。不同微生物來源的脂肪酶由于酶活中心結(jié)構(gòu)的差異，水解相同的甘油三酯 所表現(xiàn)出的脂肪酸特異性不同。選擇出對中短鏈脂肪酸具有較強(qiáng)水解能力的脂肪 酶，是制備純正、濃郁奶味香基的前提。5.2溫度7 1 40455D556065溫度也) 圖1溫度對酶解反應(yīng)的影響酶類對溫度比較敏感，溫度過高會使脂肪酶鈍化;溫度過低會抑制酶的活性， 同時(shí)也會影響底物的黏度，從而影響傳質(zhì)速度。從圖1來看，在4550C范圍內(nèi)， 溫度的升高有利于反應(yīng)的進(jìn)行，酶促反應(yīng)后風(fēng)味也隨之增強(qiáng)；在50C下，酶促反 應(yīng)的風(fēng)味最佳。但過高的溫度對風(fēng)味的生成也不利。這可能是

9、由于隨著溫度的升 高，脂肪酶變性失活的速度也迅速增加，在超過酶的適宜溫度范圍時(shí)，酶失活速 度比反應(yīng)速度大得多，從而使酶促反應(yīng)速度急劇下降。5.3催化時(shí)間用脂肪酶催化生成奶味香原料時(shí)，酶的作用時(shí)間對風(fēng)味的形成也有較大的影 響。從理論上來說，酶促時(shí)間越長，脂肪酶酶解越徹底。實(shí)際上，由于脂肪酶解 過程比較復(fù)雜，過長的反應(yīng)時(shí)間，可能會造成不良風(fēng)味物質(zhì)的生成增多，影響香 精的整體風(fēng)味，所以不一定是時(shí)間越長越好，且浪費(fèi)時(shí)間，增加成本。但如果作 用時(shí)間過短，使得反應(yīng)程度不足，風(fēng)味物質(zhì)生成太少，風(fēng)味沒有充分形成。所以要達(dá)到理想的風(fēng)味，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制好。5.4 pH值研究表明，有機(jī)相中酶最適pH與水相中酶催化的

10、最適pH是一致的。這樣在有 機(jī)溶劑中酶分子表面的必需水，在特定的pH和離子強(qiáng)度下，酶分子活性中心周圍 的基團(tuán)處于最佳的離子化狀態(tài)，有利于酶活性的表現(xiàn)。酶在有機(jī)溶劑中能保持其 制備的pH不變，可記憶其制備時(shí)的pH。在用脂肪酶來催化生成奶味香原料時(shí)，體 系的pH對風(fēng)味物質(zhì)的生成有很大的影響。油脂的水解產(chǎn)物主要是脂肪酸，如果pH 過高，脂肪酸會與OH-反應(yīng)生成脂肪鹽。在酸性條件下酶解和堿性條件下酶解，自 然會有不同的結(jié)果。5.5水如果底物在水中溶解性很差，或水是反應(yīng)的一種產(chǎn)物，那么反應(yīng)生成產(chǎn)物在 含水體系中產(chǎn)率一般很低Iwa i等用各種脂肪酸和萜醇在水體系中酯化的研究表 明，大多數(shù)脂肪酶沒有活性或活

11、性很低。水含量對脂肪酶的影響可以從兩個方面加以分析。一方面，酶需要少量的水 以保持活性的三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，水可以保持催化部位的整體性、催化部位的極化、 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。另一方面，水的存在限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性； 在酯化或水解反應(yīng)中，水含量會影響反應(yīng)的平衡點(diǎn)及產(chǎn)物在介質(zhì)中的擴(kuò)散，過量 水會導(dǎo)致酶的熱力學(xué)失活。脂肪酶適宜的含水量一必需水隨酶源不同會有明顯變 化。大量研究結(jié)果表明，有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)具有酶在水中所具備的優(yōu)點(diǎn)外， 還具有如下的特點(diǎn)：提高了非極性底物的溶解度；熱力學(xué)平衡向合成方向移 動；抑制了有水參與的副反應(yīng)；酶易回收再利用；容易從低沸點(diǎn)的有機(jī)溶 劑中分離純化產(chǎn)物；熱穩(wěn)定性顯著

12、提高，pH的適應(yīng)性擴(kuò)大；無微生物的污染。所謂非水介質(zhì)并不是絕對無水，酶維持活性有賴于其活性構(gòu)象的維持，而酶 的活性構(gòu)象的形成是依賴于各種氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)相互作用。水參與了氫鍵 的形成，而疏水相互作用也只有在有水參與時(shí)才能形成。因此，水分子與酶分子 的活性構(gòu)象形成有關(guān)。其實(shí)與酶分子起作用的只是與酶分子緊密接觸的一層束縛 水，只要保證這些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分 的自由水盡可以被有機(jī)溶劑所代替。5.6酶添加量圖4酶量對酶解反應(yīng)的影響脂肪酶催化生成奶味香原料時(shí)，其用量對風(fēng)味有較大影響。脂肪酶用量少時(shí)， 風(fēng)味物質(zhì)生成量少，奶味較淡；用量過多，雖然可以生成大量的風(fēng)味物質(zhì)

13、，但會 引起其他不良現(xiàn)象的產(chǎn)生，如產(chǎn)生不良的風(fēng)味；再者，由于酶用量過多，也會增 加生產(chǎn)成本。5.7酶載體由于脂肪酶價(jià)格昂貴，因此，酶再生與再利用是必須解決的問題。固定化脂 肪酶在一定程度上可減少溶劑導(dǎo)致的酶失活，可以使酶在反應(yīng)介質(zhì)中均勻存在， 存在的主要問題是由于酶的失活及解吸，酶活性隨循環(huán)次數(shù)而下降。載體材料一般要求有較高的機(jī)械強(qiáng)度；由于有機(jī)溶劑的存在，要求有較高的 化學(xué)隋性；載體材料應(yīng)易于酶活性再生；載體材料影響酶附近的水含量，材料上 吸附適當(dāng)?shù)乃畬Ρ３置富钚杂幸?；載體材料還會影響反應(yīng)物和產(chǎn)物的分配。6當(dāng)前研究進(jìn)展6.1超臨界流體狀態(tài)下的酶反應(yīng)超臨界流體狀態(tài)下的酶反應(yīng)是近幾年來生物工程新開

14、拓的領(lǐng)域。超臨界流體 具有類似液體的密度，類似氣體的擴(kuò)散性和粘度，因此顯示出較大的溶解能力和 較高的傳遞特性，從而大大降低酶反應(yīng)過程的傳質(zhì)阻力，提高酶反應(yīng)速率；反應(yīng) 底物的溶解性對超臨界的操作條件（如溫度、壓力）特別敏感，通過簡單改變操 作條件或附加其它設(shè)備就可達(dá)到反應(yīng)產(chǎn)物和底物、副產(chǎn)物分離的目的。在酶催化 領(lǐng)域，通過采用超臨界CO2作溶劑，它具有無毒、不可燃、化學(xué)惰性、易與反應(yīng) 底物分離、價(jià)格便宜等特點(diǎn)，可克服有機(jī)溶劑的毒性及價(jià)格高的缺點(diǎn)，且高壓連 續(xù)式的反應(yīng)操作更是有利于工業(yè)化的生產(chǎn)。Hammard等率先提出了超臨界CO2可作為酶法酯交換反應(yīng)介質(zhì)，接著Nakamura 報(bào)道了脂肪酶催化甘油

15、三酯酶交換反應(yīng)的研究結(jié)果。越來越多的研究顯示了超臨 界CO2下脂酶催化的反應(yīng)具有廣闊應(yīng)用前景。6.2微生物發(fā)酵與酶法結(jié)合目前酶法是生產(chǎn)天然奶味香原料的常用方法，但酶法制備的奶味香原料多以 中短鏈游離脂肪酸為主要香氣成分，香氣強(qiáng)度大，但香型單調(diào)，容易出現(xiàn)油味及 酸敗味。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)食品香料近幾年發(fā)展較快，微生物代謝過程中發(fā) 生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，產(chǎn)生的香氣柔和更宜被大眾接受，但風(fēng)味物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)率較 低，香氣強(qiáng)度不夠。因此將微生物發(fā)酵與酶法相結(jié)合是制備高質(zhì)量天然奶味香原 料的重要途徑。奶味香氣的特征香氣化合物以丁二酮、3羥基丁酮（乙偶姻） 為主，丁二酮可通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生。目前國內(nèi)外的研究主要集中在如何提高發(fā)酵乳中丁二酮含量方面，而較少將 微生物發(fā)酵合成丁二酮的方法應(yīng)用到天然香精香料的研制中。有學(xué)者研究選用具 有合成丁二酮能力的乳酸菌株為發(fā)酵菌株，以全脂乳為發(fā)酵原料并進(jìn)一步利用脂 肪酶對發(fā)酵液進(jìn)行修飾，制備奶香純正、濃郁的