蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法對(duì)比綜述

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法對(duì)比綜述工程碩士李瑾摘要:到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射法和NMR 法，這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和不足。關(guān)鍵詞:x射線衍射法NMR法到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射法和NMR法。其 中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，第一個(gè)解析的蛋 白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并 發(fā)展起來(lái)的。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和不足。首先是X射線晶體衍射法。該方法的前提是要得到蛋白質(zhì)的晶體。通常是將表 達(dá)目的蛋白的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆到一種表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo) 表達(dá)，目的蛋白提純之后摸

2、索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，將晶體進(jìn)行x射線衍 射，收集衍射圖譜，通過(guò)一系列的計(jì)算，得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。x射線晶體衍射法的優(yōu)點(diǎn)是:速度快，通常只要拿到晶體，最快當(dāng)天就能得出結(jié) 構(gòu)，另外不受肽鏈大小限制，無(wú)論是多大分子量的蛋白質(zhì)或者RNA、DNA，甚至是 結(jié)合多種小分子的復(fù)合體，只要能夠結(jié)晶就能夠得到其原子結(jié)構(gòu)。所以x射線方法 解析蛋白的關(guān)鍵是摸索蛋白結(jié)晶的條件。該方法得到的是蛋白質(zhì)分子在晶體狀態(tài)下 的空間結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)分子在生物細(xì)胞內(nèi)的本來(lái)結(jié)構(gòu)有較大的差別。晶體 中的蛋白質(zhì)分子相互間是有規(guī)律地、緊密地排列在一起的，運(yùn)動(dòng)性較差;而自然界 的生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分子則是處于一種溶液狀態(tài)，周

3、圍是水分子和其他的生物分 子，具有很好的運(yùn)動(dòng)性。而且，有些蛋白質(zhì)只能穩(wěn)定地存在于溶液狀態(tài)，無(wú)法結(jié)晶。核磁共振NMR(nuclear magnetic resonance)現(xiàn)象很早就被科研人員觀察到 了，但將這種方法用來(lái)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，卻是近一二十年的事情。NMR法具體原理 是對(duì)水溶液中的蛋白質(zhì)樣品測(cè)定一系列不同的二維核磁共振圖譜，然后根據(jù)已確定 的蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)各種二維核磁共振圖譜的比較和解析，在圖譜上 找到各個(gè)序列號(hào)氨基酸上的各種氫原子所對(duì)應(yīng)的峰。有了這些被指認(rèn)的峰，就可以 根據(jù)這些峰在核磁共振譜圖上所呈現(xiàn)的相互之間的關(guān)系得到它們所對(duì)應(yīng)的氫原子之間的距離。可以想象，正是因?yàn)榈鞍?/p>

4、 質(zhì)分子具有空間結(jié)構(gòu)，在序列上相差甚遠(yuǎn)的兩個(gè)氨基酸有可能在空間距離上是很近 的，它們所含的氫原子所對(duì)應(yīng)的NMR峰之間就會(huì)有相關(guān)信號(hào)出現(xiàn)。通常，如果兩個(gè)氫原子之間距離 小于0.5納米的話(huà)，它們之間就會(huì)有相關(guān)信號(hào)出現(xiàn)。一個(gè)由幾十個(gè)氨基酸殘基組成 的蛋白質(zhì)分子可以得到幾百個(gè)甚至幾千個(gè)這樣與距離有關(guān)的信號(hào)，按照信號(hào)的強(qiáng)弱 把它們轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的氫原子之間的距離，然后運(yùn)用計(jì)算機(jī)程序根據(jù)所得到的距離條 件模擬出該蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)既要滿(mǎn)足從核磁共振圖譜上得到的所有 距離條件，還要滿(mǎn)足化學(xué)上有關(guān)原子與原子結(jié)合的4一些基本限制條件，如原子間的化學(xué)鍵長(zhǎng)、鍵角和原子半徑等。NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)常規(guī)步驟如下:首

5、先通過(guò)基因工程的方法，得到提純的目的蛋 白，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的條件下，將未聚合，而且折疊良好的蛋白樣品(通常是 1mM,3mM，500ul，PH6,7的PBS)裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后由寫(xiě)好的程 序控制譜儀，發(fā)出一系1313列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N、C原子，等電磁波發(fā)射完畢，再收集受 激發(fā)的原子所6放出的“能量”，通過(guò)收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計(jì)算從而得到蛋白 的原子結(jié)構(gòu)。用NMR研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，可以在溶液狀態(tài)進(jìn)行研究，得到的是蛋白質(zhì)分 子在溶液中的結(jié)構(gòu)，這更接近于蛋白質(zhì)在生物細(xì)胞中的自然狀態(tài)。此外，通過(guò)改 變?nèi)芤旱男再|(zhì)，還可以模擬出生物細(xì)胞內(nèi)的各種生理?xiàng)l件，即蛋白質(zhì)分子所處的

6、各 種環(huán)境，以觀察這些周?chē)h(huán)境的變化對(duì)蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的影響。在溶液環(huán)境 中，蛋白質(zhì)分子具有與自然環(huán)境中類(lèi)似的運(yùn)動(dòng)性，可以觀察到整個(gè)結(jié)構(gòu)表面的一些松散鏈段的運(yùn)動(dòng)性，而蛋白質(zhì)的 活性部位往往是在整個(gè)結(jié)構(gòu)的表面，因此NMR方法為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與底 物或小分子的相互作用提供了一個(gè)有效的觀察手段。到目前為止，用該方法來(lái)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 已經(jīng)十非常成熟。它的優(yōu)點(diǎn)就是，蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，事 實(shí)上所有已發(fā)表的NMR結(jié)構(gòu)都是十個(gè)或者二十個(gè)結(jié)構(gòu)的ensemble（集合），這就是 因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)都是進(jìn)行能量?jī)?yōu)化后符合條件的結(jié)構(gòu)，或者說(shuō)就是溶液中的蛋白結(jié) 構(gòu)。因?yàn)槭莿?dòng)態(tài)就很容易的研究蛋白

7、與其他蛋10白或者配基的相互作用。缺點(diǎn)是，該方法受蛋白質(zhì)大小的限制，到目 前為止NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)的上限是50kd。從1980年代初NMR法出現(xiàn)至今，核磁共振技術(shù)在生物大分子的結(jié)構(gòu)研究方面 有了飛速的發(fā)展，一方面是由于儀器技術(shù)本身的發(fā)展，能夠產(chǎn)生的磁場(chǎng)越來(lái)越強(qiáng)； 計(jì)算機(jī)的計(jì)算速度也越來(lái)越快，更多地是由于實(shí)驗(yàn)方法上的創(chuàng)新和發(fā)展，由二維的 核磁共振實(shí)驗(yàn)發(fā)展成三維甚至更多維的實(shí)驗(yàn)。借助于基因技術(shù)可以得到同位素富集的蛋白質(zhì)樣品， 核磁共振的實(shí)驗(yàn)也從原來(lái)單一的核發(fā)展到三種甚至四種核同時(shí)在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中共振而 產(chǎn)生相關(guān)信號(hào)。核磁共振方法的應(yīng)用范圍也從原來(lái)單一的蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)研 究發(fā)展到蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方面的

8、研究，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸以及小分子的 相互作用和藥物篩選中蛋白質(zhì)分子與藥物分子的結(jié)合等方面。在此過(guò)程中，NMR技術(shù)始終處于發(fā)展的前沿，圍繞這 一技術(shù)提出的許多原創(chuàng)性觀點(diǎn)和方法已被廣泛地接受和應(yīng)用。隨著人類(lèi)基因組學(xué)和 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組學(xué)的研究也會(huì)隨之興起，核磁共振技術(shù) 在這方面的應(yīng)用會(huì)更多更廣。這些應(yīng)用的需求反過(guò)來(lái)也會(huì)促進(jìn)核磁共振技術(shù)本身的 進(jìn)步和發(fā)展，使之更趨成熟和完善。參考文獻(xiàn)：.李蘭芬，南潔，and蘇曉東，蛋白質(zhì)晶體學(xué)技術(shù)的發(fā)展與展望.生物物 理學(xué)報(bào)，2007(04).江凡，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論方法.物理，2007(04).姜厚理，馮銳，and杜澤

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