蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法對比綜述

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法對比綜述工程碩士李瑾摘要:到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射法和NMR 法，這兩種方法各有優(yōu)點和不足。關(guān)鍵詞:x射線衍射法NMR法到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射法和NMR法。其 中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，第一個解析的蛋 白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并 發(fā)展起來的。這兩種方法各有優(yōu)點和不足。首先是X射線晶體衍射法。該方法的前提是要得到蛋白質(zhì)的晶體。通常是將表 達目的蛋白的基因經(jīng)PCR擴增后克隆到一種表達載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導 表達，目的蛋白提純之后摸

2、索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，將晶體進行x射線衍 射，收集衍射圖譜，通過一系列的計算，得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。x射線晶體衍射法的優(yōu)點是:速度快，通常只要拿到晶體，最快當天就能得出結(jié) 構(gòu)，另外不受肽鏈大小限制，無論是多大分子量的蛋白質(zhì)或者RNA、DNA，甚至是 結(jié)合多種小分子的復合體，只要能夠結(jié)晶就能夠得到其原子結(jié)構(gòu)。所以x射線方法 解析蛋白的關(guān)鍵是摸索蛋白結(jié)晶的條件。該方法得到的是蛋白質(zhì)分子在晶體狀態(tài)下 的空間結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)分子在生物細胞內(nèi)的本來結(jié)構(gòu)有較大的差別。晶體 中的蛋白質(zhì)分子相互間是有規(guī)律地、緊密地排列在一起的，運動性較差;而自然界 的生物細胞中的蛋白質(zhì)分子則是處于一種溶液狀態(tài)，周

3、圍是水分子和其他的生物分 子，具有很好的運動性。而且，有些蛋白質(zhì)只能穩(wěn)定地存在于溶液狀態(tài)，無法結(jié)晶。核磁共振NMR(nuclear magnetic resonance)現(xiàn)象很早就被科研人員觀察到 了，但將這種方法用來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，卻是近一二十年的事情。NMR法具體原理 是對水溶液中的蛋白質(zhì)樣品測定一系列不同的二維核磁共振圖譜，然后根據(jù)已確定 的蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)，通過對各種二維核磁共振圖譜的比較和解析，在圖譜上 找到各個序列號氨基酸上的各種氫原子所對應(yīng)的峰。有了這些被指認的峰，就可以 根據(jù)這些峰在核磁共振譜圖上所呈現(xiàn)的相互之間的關(guān)系得到它們所對應(yīng)的氫原子之間的距離?？梢韵胂?，正是因為蛋白

4、 質(zhì)分子具有空間結(jié)構(gòu)，在序列上相差甚遠的兩個氨基酸有可能在空間距離上是很近 的，它們所含的氫原子所對應(yīng)的NMR峰之間就會有相關(guān)信號出現(xiàn)。通常，如果兩個氫原子之間距離 小于0.5納米的話，它們之間就會有相關(guān)信號出現(xiàn)。一個由幾十個氨基酸殘基組成 的蛋白質(zhì)分子可以得到幾百個甚至幾千個這樣與距離有關(guān)的信號，按照信號的強弱 把它們轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的氫原子之間的距離，然后運用計算機程序根據(jù)所得到的距離條 件模擬出該蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)既要滿足從核磁共振圖譜上得到的所有 距離條件，還要滿足化學上有關(guān)原子與原子結(jié)合的4一些基本限制條件，如原子間的化學鍵長、鍵角和原子半徑等。NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)常規(guī)步驟如下:首

5、先通過基因工程的方法，得到提純的目的蛋 白，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的條件下，將未聚合，而且折疊良好的蛋白樣品(通常是 1mM,3mM，500ul，PH6,7的PBS)裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后由寫好的程 序控制譜儀，發(fā)出一系1313列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N、C原子，等電磁波發(fā)射完畢，再收集受 激發(fā)的原子所6放出的“能量”，通過收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白 的原子結(jié)構(gòu)。用NMR研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，可以在溶液狀態(tài)進行研究，得到的是蛋白質(zhì)分 子在溶液中的結(jié)構(gòu)，這更接近于蛋白質(zhì)在生物細胞中的自然狀態(tài)。此外，通過改 變?nèi)芤旱男再|(zhì)，還可以模擬出生物細胞內(nèi)的各種生理條件，即蛋白質(zhì)分子所處的

6、各 種環(huán)境，以觀察這些周圍環(huán)境的變化對蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的影響。在溶液環(huán)境 中，蛋白質(zhì)分子具有與自然環(huán)境中類似的運動性，可以觀察到整個結(jié)構(gòu)表面的一些松散鏈段的運動性，而蛋白質(zhì)的 活性部位往往是在整個結(jié)構(gòu)的表面，因此NMR方法為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與底 物或小分子的相互作用提供了一個有效的觀察手段。到目前為止，用該方法來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 已經(jīng)十非常成熟。它的優(yōu)點就是，蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個動態(tài)的結(jié)構(gòu)，事 實上所有已發(fā)表的NMR結(jié)構(gòu)都是十個或者二十個結(jié)構(gòu)的ensemble（集合），這就是 因為這些結(jié)構(gòu)都是進行能量優(yōu)化后符合條件的結(jié)構(gòu)，或者說就是溶液中的蛋白結(jié) 構(gòu)。因為是動態(tài)就很容易的研究蛋白

7、與其他蛋10白或者配基的相互作用。缺點是，該方法受蛋白質(zhì)大小的限制，到目 前為止NMR解析蛋白結(jié)構(gòu)的上限是50kd。從1980年代初NMR法出現(xiàn)至今，核磁共振技術(shù)在生物大分子的結(jié)構(gòu)研究方面 有了飛速的發(fā)展，一方面是由于儀器技術(shù)本身的發(fā)展，能夠產(chǎn)生的磁場越來越強； 計算機的計算速度也越來越快，更多地是由于實驗方法上的創(chuàng)新和發(fā)展，由二維的 核磁共振實驗發(fā)展成三維甚至更多維的實驗。借助于基因技術(shù)可以得到同位素富集的蛋白質(zhì)樣品， 核磁共振的實驗也從原來單一的核發(fā)展到三種甚至四種核同時在一個實驗中共振而 產(chǎn)生相關(guān)信號。核磁共振方法的應(yīng)用范圍也從原來單一的蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)研 究發(fā)展到蛋白質(zhì)動力學方面的

8、研究，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸以及小分子的 相互作用和藥物篩選中蛋白質(zhì)分子與藥物分子的結(jié)合等方面。在此過程中，NMR技術(shù)始終處于發(fā)展的前沿，圍繞這 一技術(shù)提出的許多原創(chuàng)性觀點和方法已被廣泛地接受和應(yīng)用。隨著人類基因組學和 蛋白質(zhì)組學研究的不斷深入，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組學的研究也會隨之興起，核磁共振技術(shù) 在這方面的應(yīng)用會更多更廣。這些應(yīng)用的需求反過來也會促進核磁共振技術(shù)本身的 進步和發(fā)展，使之更趨成熟和完善。參考文獻：.李蘭芬，南潔，and蘇曉東，蛋白質(zhì)晶體學技術(shù)的發(fā)展與展望.生物物 理學報，2007(04).江凡，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的實驗技術(shù)和理論方法.物理，2007(04).姜厚理，馮銳，and杜澤

9、涵，核磁共振測定蛋白質(zhì)構(gòu)象.軍事醫(yī)學科學 院院刊，1993(02).胡紅雨and魯子賢，核磁共振法研究蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)構(gòu)和功能.化學 通報，1995(07).施燕紅，郭晨云，and林東海，蛋白質(zhì)NMR樣品制備技術(shù).生命的化學， 2006(02).朱春明，et al.,基因工程法制備(15)N標記的蛋白質(zhì)樣品.清華大學 學報(自然科學版)，1999(06).黃鶴，et al.,多肽和蛋白質(zhì)NMR預(yù)飽和實驗中飽和轉(zhuǎn)移效應(yīng)的研究.波譜學雜志，1998(05).高廣華and王大成，蛋白質(zhì)溶液NMR結(jié)構(gòu)測定的一些新進展.生物化學 與生物物理進展，1999(03).施蘊渝and吳季輝，核磁共振波譜研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及功能.中國科 學技術(shù)大學學報，2008(08).林東海and洪晶，用NMR技術(shù)研究蛋白質(zhì)-配體相互作用.波譜學雜志, 200