基本常用技術(shù)

1、第四章 細胞培養(yǎng)中的基本方法細胞培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié) 無菌技術(shù)防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。細胞培養(yǎng)工具做到細胞培養(yǎng)專用進出細胞培養(yǎng)室做到更衣?lián)Q鞋超凈工作臺紫外照射時不要放置過多物品遮擋紫外線一、操作區(qū)消毒1.使用紫外線燈滅菌，照射細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺20-30min。2.在用紫外線燈照射期間，超凈工作臺上放置物品不要過多，留有死角阻礙照射，勿置培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時可用紙張覆蓋)。3.所有操作用具（包括培養(yǎng)瓶）要經(jīng)75%的乙醇擦拭后才可放置進超凈工作臺內(nèi)。4.實驗開始前使用75%的乙醇擦拭超

2、凈工作臺臺面。二、洗手和著裝1.進入細胞培養(yǎng)室更換專用室內(nèi)鞋和無菌服、帽子和手套。2. 使用75%酒精或0.2%的新潔爾滅洗手。3.實驗過程中可能觸及污染物品或者出入培養(yǎng)室均要洗手。三、火焰消毒1.在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作,需要在酒精燈附近進行。2.實驗中使用器械均要經(jīng)過火焰燒灼進行。3.金屬器械不宜灼燒長，防止退火和過熱。4.含營養(yǎng)液的吸管不要灼燒防止營養(yǎng)液碳化。5.培養(yǎng)瓶口過火時間不要太長防止燒死細胞。四、培養(yǎng)操作1.操作臺面布局合理2.不用手觸及已消毒物品3.操作保持一定順序，動作準確敏捷4.組織或細胞在未做處理前或培養(yǎng)液在未用前，勿過早暴露在

3、空氣中；用過之后如不再重復使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5.防止各種用液的交叉污染。6.不向操作方向講話或咳嗽原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。意義:1.原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細胞表現(xiàn)出原來組織的特性。2.利用原代培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。3.原代培養(yǎng)也是建立各種細胞系（株）必須經(jīng)過的階段。第二節(jié) 原代培養(yǎng)取材原則：1.幼體組織尤其是胚胎組織比年老個體的組織容易培養(yǎng)；2.分化程度低的組織比分化程度高的容易生長；3.腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。4.取材之后，

4、最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時，應(yīng)把組織切成1 立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4貯存，存放時間不宜超過24 小時。5.從體內(nèi)取材時，應(yīng)嚴格保持無菌，避免受到紫外線照射或接觸任何化學試劑及有害藥物如碘、汞等。取腫瘤和其它病理組織時容易帶菌，為減少污染，可用含500-1000 單位毫升的青、鏈霉素BSS 液，漂洗5-10 分鐘后再做培養(yǎng)處理。取鼠胚組織引頸法處死小鼠整個小鼠浸入75酒精中2 3 秒鐘打開胸腔取出組織組織的分離：從體內(nèi)取出的各種組織均由眾多細胞和纖維成分組成，而且結(jié)合十分緊密。為獲取多量生長良好的細胞，必須把組織細胞分散開，使細胞解離出來。機械法化學法機械法：把組織塊先剪成小塊后

5、，把組織放入注射器針管中使用壓擠法，或是把組織置于不銹鋼紗網(wǎng)中用鈍物壓取法。其中以壓取法較多用。簡便易行，節(jié)省時間，但對組織有一定損傷，僅適用于處理軟組織。化學法：在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學手段進一步分散組織，最后制成細胞團或單個細胞懸液接種的方法。最常用的消化酶是胰蛋白酶和膠原酶兩種。93原代細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層離體培養(yǎng)的細胞群體增殖達到一定密度時，細胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶

6、的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化。第三節(jié) 傳代培養(yǎng)貼壁細胞的傳代培養(yǎng)1.選取生長良好的細胞，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的PBS，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片。2.加入適量0. 0.25胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。3.用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復吹打細胞，使其成細胞懸液。4.使用臺盼藍進行細胞計數(shù)，按照計數(shù)結(jié)果進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 ，5%CO2培養(yǎng)。 5.24h后觀察的生長情況。懸液細胞的傳代培養(yǎng)1.取生長良好的細胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培

7、養(yǎng)瓶中的細胞吹打均勻。2.轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1 000r/min）5min。3.在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞，制成懸液。4.使用臺盼藍計數(shù)，按照結(jié)果進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 ，5%CO2培養(yǎng)。 5.24h后觀察的生長情況。細胞計數(shù)法是細胞學實驗的一項基本技術(shù)，是用于了解培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)，測定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質(zhì)對細胞發(fā)揮作用的重要手段。 血球計數(shù)板計數(shù)法 電子細胞計數(shù)儀計數(shù)法 第四節(jié) 細胞計數(shù)方法和步驟1.取酒精棉球清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，并用絲綢布或擦鏡紙輕輕拭干。2.用胰酶消化分散貼壁細胞或

8、直接收集懸浮細胞制成均勻分散的單細胞懸液，必要時應(yīng)進行適當?shù)南♂尰驖饪s。3.混勻后直接取少許細胞懸液，沿計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細胞懸液。加樣量以充滿不外溢為宜，也不要過少或出現(xiàn)氣泡。4.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，分別數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細胞數(shù)。對壓邊線細胞：計上不計下，計左不計右 計算：一般以每毫升含細胞數(shù)來表示 大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3104，才為1ml體積。所以計算公式為：細胞懸液的細胞數(shù)）/ml（四個大格子細胞數(shù)/4)104稀釋倍數(shù)計數(shù)中，如果細胞懸液

9、的細胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細胞數(shù)太少,可離心濃縮后再計。每個細胞懸液至少滴樣兩次求平均值。不要漏計，不要重復，細胞懸液應(yīng)混合均勻，濃度不可過高也不可過低。細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cell growth curve)是觀測細胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標，可根據(jù)細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。 制作方法：1.培養(yǎng)細胞 首先在2孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞。計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為0 h。2.計數(shù)細胞密度 從接種時間算起，每隔24h計數(shù)孔內(nèi)的細胞密度，算出平均值

10、。為提高準確率，對每孔細胞可計數(shù)23次。如此操作至第七天結(jié)束。3.繪制曲線 以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，將全部結(jié)果在坐標紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長曲線。培養(yǎng)細胞的生長曲線第五節(jié) 活細胞的染料排除檢測法原理：由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細胞。最常用的為“臺盼藍排除檢測法” 實驗方法： 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4、鏡下取

11、幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。臺盼藍染細胞時，時間不宜過長。否則，部分活細胞也會著色，會干擾實驗結(jié)果。1776年， “冷”處理對“細胞”生命活動影響的報道。1900年前后，基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存。1949年，發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。1959年，發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是現(xiàn)在常用的二甲基亞砜(DMSO)。當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù) ，貯存時間幾乎是無限的。 第七節(jié)、細胞的凍存與復蘇一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復蘇原理冷凍保存(cryo

12、preservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復蘇(thawing)：是以一定的復溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復到常溫的過程。 細胞凍存時，存在兩種損傷：冰晶損傷 溶質(zhì)損傷冰晶損傷：由于溫度下降，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞并引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)、外結(jié)冰而致的細胞損傷被稱為細胞的冰晶損傷。 冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷。細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降

13、，細胞外部的水分會先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏。 溶質(zhì)損傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴重。 如果在溶液中加入冷凍保護劑時，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。保護機理：冷凍保護劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成 ；通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。 影響冷凍效果的因素有以下幾點：1.冷凍速率當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失

14、去活性。冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當冷凍速度過快時，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。2.冷凍保存溫度：液氮溫度(-196)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70-80條件冷凍保存細胞，短期內(nèi)對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯下降。 4.冷凍保護劑（滲透性 非滲透性）： 滲透性常用甘油、DMSO 滲透到細胞內(nèi)，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時，細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能

15、防止細胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。 非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類保護劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。二、使用逐級降溫法進行凍存1.主要材料(1)儀器設(shè)備：普通冰箱、-30低溫冰箱和-70-80超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機等。(2)凍存管：容量為2ml。(3)冷凍保護液：一般是以含20%小牛血清的細胞培養(yǎng)液與二甲基亞

16、砜1份以9：1混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴融解。(4)待凍存細胞。2.細胞處理過程(1)按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物,制備成單細胞懸液,計算細胞總數(shù)。(2)將細胞懸液以8001000rmin離心5min，棄上清液。(3)向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細胞密度達11061107個/ml。(4)按每管11.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。(5)在凍存小管上做標記，包括細胞代號及凍存日期。3.分級冷凍：（1）標準程序為-25以上時，下降-2-1 /min；-25以下時，下降-10-5/min；溫度達到-100 時，可迅速放入

17、液氮（2）實際可采用普通冰箱冷藏層(48)，約40min；普通冰箱冷凍層(-10-20)，3060min；在-70-80下過夜；最后將凍存小管投入液氮保存。凍存的細胞存活率可達90%以上?？墒褂眉毎麅龃婧羞M行一次性冷凍。注意事項：在使用DMSO前，不需要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。 在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制冷凍保護劑時最好帶手套。凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以避免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。 勿將凍存的細胞放置在0-60這一溫度范圍內(nèi)過長時間，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內(nèi)。三、細胞復蘇1.主要材料(1)儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、普通離心機。(2)培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液（

18、20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）2.復蘇過程(1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至3740。(2)從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成復溫。(3)將細胞凍存懸液移入離心管。 (4)將細胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。(5)給細胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。注意事項：細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。實驗人員在復蘇細胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。 在冷凍復蘇中遵循：慢凍速溶原則！四、細胞運送液氮或干冰保存運輸或充液法運輸。1.選生長狀態(tài)良好的細胞，待達80%或90%匯合時，去掉舊培養(yǎng)液換入