同濟大學細胞生物學課件-細胞生物學的研究技術

1、第二章 細胞生物學的研究技術第一節(jié) 顯微技術一、光學顯微技術（一）光學顯微鏡技術 （二）光學顯微制片技術二、電子顯微技術第二節(jié) 細胞培養(yǎng)及細胞組分的分離技術一、細胞培養(yǎng)技術二、細胞器的分離與提純技術三、細胞成分的分析技術第一節(jié) 顯微技術一、光學顯微技術（一）光學顯微鏡技術光源: 可見光等聚光鏡、目鏡、物鏡分辨力，指人眼在25cm的明視距離處分辨物體結(jié)構(gòu)最小間距的能力一般光鏡的分辨力為0.39m，放大倍數(shù)可達1600倍光學顯微鏡類型普通光學顯微鏡相差顯微鏡暗視野顯微鏡熒光顯微鏡共焦點激光掃描顯微鏡普通光學顯微鏡 用于細胞一般形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，如細胞核、核仁、細胞膜、線粒體、中心體、高爾基體、染色體

2、等相差顯微鏡環(huán)形光闌相板 通過改變光線的振幅差，提高細胞結(jié)構(gòu)的對比度而提高分辨力。主要用于活體細胞的觀察暗視野顯微鏡 特殊聚光器（遮光板），視野的背景是黑暗的，而被檢物體為亮點熒光顯微鏡以紫外光作光源，激發(fā)標本中的熒光物質(zhì)使其發(fā)射熒光葉綠體能自發(fā)產(chǎn)生紅色熒光有些需經(jīng)過熒光染料 如吖啶橙等染色才能DNA、RNA產(chǎn)生熒光（二）光學顯微制片技術制片：血液、骨髓及表皮組織可直接涂片或鋪片固體組織材料則需通過組織切片或壓片石蠟包埋切片：組織材料經(jīng)甲醛、戊二醛等固定劑固定，乙醇等脫水，石蠟包埋，切片染色如鐵蘇木精伊紅(H.E)染色觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)硝酸根染色觀察高爾基體鐵蘇木精染色觀察于線粒體蘇丹染料觀察脂

3、肪滴其它方法細胞中酶的顯示化學成分如DNA、RNA顯示酶標記放射自顯影膠體金標記二、電子顯微技術德國科學家 Knolls和 Ruska 1932年發(fā)明電子顯微鏡電子束代替光線電磁場透鏡代替玻璃透鏡最大分辨力約為2nm，直接放大倍數(shù)可達80萬倍左右電鏡的分類透射式電鏡(transmission electron microscope,TEM)掃描式電鏡(scanning electron microscope, SEM)透射電鏡觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)材料必須固定、脫水后用環(huán)氧樹脂等包埋，超薄切片機切成50100nm的超薄片，并用硝酸鉛、醋酸鈾等染色電鏡原理圖電鏡結(jié)構(gòu)圖掃描電鏡電子槍發(fā)射的電子束形成電子

4、探針掃描，收集二次電子、轉(zhuǎn)換后放大，在熒光屏上成像標本需干燥、鍍金(使標本導電)用于細胞或組織材料的表面立體圖像的觀察分析掃描電鏡外觀掃描電鏡照片電鏡標本特殊處理負染色冰凍切片金屬投影冷凍蝕刻放射自顯影酶標記第二節(jié) 細胞培養(yǎng)及細胞組分的分離技術 一、細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)：從多細胞生物的機體中用無菌操作的方法取出活體細胞，在體外模擬類似機體的溫度、pH值、營養(yǎng)條件，使其繼續(xù)生存、生長并進行傳代繁殖的過程。原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primary culture)直接從體內(nèi)獲取組織細胞的首次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(subculture)從原代培養(yǎng)的細胞中分取一部分進行的擴大培養(yǎng)或再次培養(yǎng)。細胞株與細胞系

5、細胞株(Cell Strain) 細胞在傳代培養(yǎng)中仍能保持正常的二倍體染色體數(shù)及接觸抑制行為，成為細胞株細胞系(Cell Line) 細胞發(fā)生遺傳改變，染色體出現(xiàn)非正倍體，細胞接觸抑制消失，往往可無限傳代 Hela細胞系細胞培養(yǎng)示意圖二、細胞器的分離與提純技術差速離心法低速(1000轉(zhuǎn)/分)短時間(15分鐘)離心可首先將較大的細胞核沉淀下來 高速(800025000轉(zhuǎn)/分)離心可使次大的線粒體分離超速(2500085000轉(zhuǎn)/分)離心，可收集溶酶體等封閉小泡以及核糖體。密度梯度離心以蔗糖、甘油、氯化銫作為介質(zhì)離心時介質(zhì)形成密度梯度不同大小的顆粒形成相應的密度帶三、細胞成分的分析技術細胞原位分析方法通過特殊染色、標記，如孚爾根(Feulgen)反應是特異顯示細胞內(nèi)DNA存在部位的方法放射自顯影(autoradiography)利用放射性同位素3H、32P 125I、14C等標記， 敷以感光乳膠，感光、顯影后，通過光鏡或電鏡觀察，可了解被標記物質(zhì)的分布情況及含量。膠體金標記技術膠體金標記可用于光鏡，透式電鏡和掃描電鏡層析蛋白質(zhì)混合液通過含有多孔固體基質(zhì)的柱，不同的蛋白質(zhì)與基質(zhì)相互作用而被不同程度的滯留，當其從柱底流出時，即可被分別收集。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS：十二烷基硫酸鈉使蛋白質(zhì)展開成為伸展的多肽鏈聚丙烯酰胺凝膠中電泳復雜的蛋白質(zhì)混合物按分