細胞培養(yǎng)過程中的污染

1、細胞培育過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括全部混入培育環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞 不純的物質(zhì)，包括生物和化學物質(zhì)。培育細胞受細菌污染后，會消失培育液變混濁，pH轉(zhuǎn)變。也有的培育液肉眼觀看無多少轉(zhuǎn)變，只能在鏡下 覺察菌體才知污染。所以，每天應認真觀看。污染后細胞發(fā)生病理轉(zhuǎn)變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最終變圓 脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株（系）喪失。培育細胞受真菌污染后，可見培育液中漂移著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培育液一般不發(fā)生混 濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交叉在細胞之間或培育基中，有的呈鏈狀排列。念 珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，

2、有增多趨勢。鏡下看時，要將培育瓶用酒精 棉球擦潔凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最終由于養(yǎng) 分耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2pm, 一般過濾除菌無法去除它， 光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開頭不易覺察，能在偏堿條件（PH7.68.0）下生存，對青霉素有抗藥性， 多吸附于細胞外表或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中心有電子密度大的密集顆 ?；蚪z狀的中心囊。培育細胞受支原體污染后，局部敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，局部細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細 胞污染后無明顯變化，或略有

3、變化，假設不準時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。采納組織細胞培育法生產(chǎn)疫苗，假如沒有除去潛在病毒的組織培育物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴 腎細胞的培育中已覺察不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培育，但生產(chǎn)疫苗是擔憂 全的。假設二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異 倍體的細胞系。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。五、非同種細胞污染由于細胞培育操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當，往往會使一種細胞被另一種細 胞污染。如靈長類細胞系覺察猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分別

4、出來的，而現(xiàn)在卻認 為是HeLa細胞。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使很多試驗宣告無效。非細胞培育物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培育所需物品清洗消毒不徹底而帶入 一些有毒化學物質(zhì)所致。其次節(jié)污染來源及鑒別一、污染來源細胞培育過程中污染的來源主要有以下幾條途徑。1、不潔的動物組織標本很多動物組織本該是無菌的（直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外），但由于取材時不留神也 會有污染的機會。組織本身含有細菌，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌，造成細胞污染。2、空氣空氣中含有大量的微生物，假如操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下，很簡單造成污染

5、。此外，凈化工 作臺使用過久，濾板未定期更換或長期不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時不帶口罩或外界氣流過強，污染 空氣進入操作區(qū)，也會導致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不留意也易造成污 染。3、清洗消毒培育用物品、材料洗刷不凈，培育用液和器材滅菌不徹底也會引入微生物和有毒物質(zhì)。4、操作來自操作者的污染主要有以下幾方面：器材和溶液使用前未認真檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時隔已久又末 重新處理。操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細菌和支原體。培育瓶口未用75%酒精擦和燒灼。操作者不留神，動作不正確而將吸管或無菌器具遇到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外

6、壁等。操作者操作時大聲說話，來回走動揚起灰塵等。5、血清市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。二、污染的鑒別（-）細菌、真菌污染的檢測.肉眼觀看細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生快速，假設有污染，在48小時內(nèi) 可明顯觀看到。如培育液變混濁，或略加振蕩有很多漂移物漂起。.鏡下觀看在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培育液中有大量圓球狀顆粒漂移，即為細菌污染。假設細胞之間有絲狀、管狀、 樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。.接種觀看采納一般肉湯接種或用未加雙抗藥物的培育液接種，也可覺察是否有污染。（二）支原體污染的檢測.相差顯微鏡觀看將細胞接種于事先放置于培育瓶內(nèi)的支持物（一般

7、用長形蓋玻片），24小時后用清潔塵鎮(zhèn)子從培育瓶中取 出支持物，細胞面對上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀看；假設不用支持物培育法，直 接取少許培育液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀看亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞 之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。應留意與細胞破裂溢出的內(nèi)容物如線粒體等和區(qū)分。.低漲處理地衣紅染色觀看（1）取已在培育瓶中的支持物蓋片或培育液，用新奇配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細胞。（2）用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。（3）用培育液時，先吸取1mL, 500800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL,將0.

8、5%枸椽酸溶 液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定。（4）離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成23張涂片。（5）然后用2%醋酸依地紅（地衣紅2g,冰醋酸60mL,加蒸儲水至100mL）染5分鐘。（6）純酒精過三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中。假設染色過深，可先用75%酒精脫色，再封片。（7）鏡下觀看見支原體呈暗紫色小點，位于細胞外或細胞之間。.熒光染色法觀看用熒光染料Hoechst33258,此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微 鏡觀看。染色方法為：（1）用支持物蓋片培育法將細胞接種在蓋片上，在細胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿

9、中。（2）用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘。（3）用生理鹽水漂洗后置于50pg/mL的Hoechst33258（生理鹽水配制）中染色10分鐘。（4）置于蒸偏水漂洗12分鐘，向細胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液。（5）置熒光顯微鏡下觀看。假設用細胞培育液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分 鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸鐳水漂洗，離心去上清蒸儲 水，加35滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后 觀看。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散

10、在于細胞四周或附于細胞外表。.電鏡檢測假設條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀看。一般在細胞培育4872小時，細胞接近匯合前，用胰酶消 化細胞制成細胞懸液后進行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進行觀看。具體方法同細胞形態(tài)觀看法（見 第九章）。.培育檢測（1）將2.5X109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培育基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可）， 培育14天后觀看肉湯培育有無霧狀沉淀。（2）然后取0.5ml加入已冷卻到50的培育基中，再用瓊脂培育基做分別培育。37培育3天觀看有無荷包蛋菌落消失。第三節(jié)污染的清除和預防一、污染的清除培育細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。假如污染細胞價值不大，

11、宜棄之。有細胞株留存的或可購置的，可在 查找緣由后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培育。假設污染細胞價值較大，又難于重新得到，可 實行以下方法清除。.使用抗生素抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般 用雙抗生素（青霉素100u/mL加鏈霉素lOOpg/mL）,污染后清除用藥需采納大于常用量510倍的沖洗法， 于加藥后作用2448小時，再換常規(guī)培育液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、 四環(huán)素、制霉菌素等。常用400800|jg/mL卡那霉素或200|jg/mL四環(huán)素處理，每隔

12、23 口換液1次, 傳12代進行治療。近年來有報道，4-氟，2-羥基唾咻（Ciprofloxacin,Cip）、截耳素衍生物 （Pleu-romutilinderivative, BM-Cyclin2:BM-l和四環(huán)素衍生物（BM-2）等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體 有效。.加溫處理將污染的組織培育物放在41培育18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行 預試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細胞影響最小的加熱時間。此法有時不行靠。假設先用藥物處理后， 再以41加溫處理效果更佳。.使用支原體特異性血清用5%的兔支原體免疫血清（血凝效價1:320以上）可去除支原體污染，因特

13、異抗體可抑制支原體生長，故 經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比擬麻煩，不如用抗生素便利、經(jīng)濟 4.其他方法除了上述去除污染的方法外，還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培育瓶中加浸尿嚏咤再用 光照耀的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特殊重要價值，一 般均棄之重新培育。二、污染的預防預防是防止細胞培育過程中發(fā)生污染的最好方法。只有預防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最 小程度。一般預防可從以下幾方面著手。1.從物品、用品消毒滅菌著手細胞培育所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要認真，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室 及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。2、從操作者做起（1）操作者責任心耍強，要細心穩(wěn)重，操作技術(shù)要嫻熟。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸 泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工作開頭要先用75%酒精棉球擦手、擦 瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培育物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)， 更不能任憑使用，以免造成大批污染。（2）操作者動作要輕，必需在火焰四周無菌區(qū)內(nèi)翻開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話， 假設打噴嚏或咳嗽應轉(zhuǎn)向反面。（3）操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做究竟。一旦覺察吸管口接觸了手和其他污染物品應棄