高質(zhì)量DNA獲取方法

1、從組織中獲取DNA難嗎？不難，真不難。高一就有開設(shè)的從雞血中獲取DNA 的生物實驗課，很簡單的幾步就可以得到DNA。但要想獲取高質(zhì)量的DNA，尤 其是從一些富含多糖、多酚、淀粉、纖維和蛋白的組織，后面用于酶切、高通量 測序大片段文庫的構(gòu)建，還是有一定的難度的。最近協(xié)助北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心一個老師提取桃葉片DNA還是遇到了 一些困難，因為老師要做桃的個體重測序，因此對DNA的要求還是非常高的。 之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法，有 些老師購買試劑盒進行提取，其實很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB。 CTAB法是提取植物DNA非常經(jīng)典方法，但在提取的過

2、程中由于要在65C水浴 中放置1個小時，因此耗時較長。我們在使用該法提取桃DNA時，獲得DNA 中含有大量的蛋白和多糖，雖然通過多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但 DNA得率較低。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質(zhì)量DNA的方法，供大 家在提取植物DNA時作為參考，用該法提取的植物DNA完全滿足后續(xù)酶切、 BAC文庫構(gòu)建、高通量測序大片段文庫構(gòu)建，將該法稱之為月桂酸鈉法。月桂酸鈉抽提緩沖液：Tris-Hcl (pH8.0) 100mmol/L； NaCl 100mmol/L； EDTA (pH8.0) 20mmol/L； 月桂酸鈉1%；配法：準確稱取NaCl 5.844g，月桂酸鈉10g置

3、于1000mL燒杯中，加入 100ml Tris-Hcl (1M)以及 40mLEDTA (0.5M)、800mlddH2O，用鹽酸調(diào)節(jié) pH至8.0，定容至10000mL，滅菌后室溫保存。月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine分子式：C15H28NaO3N，分子 量：293.39。以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實驗流程：選取適量的玉米幼苗新鮮葉片，以紗布捆扎，做好標記，置于液氮中保 存；研缽以液氮預(yù)冷，將玉米葉片置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末 級，期間時時加入液氮，防止研磨過程中DNA被降解；將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中，用移液管加入10

4、mL 月桂酸鈉抽提緩沖液，反復(fù)緩慢的搖勻；用移液管向50mL抽提試管中加入等體積(10mL)酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1)，反復(fù)緩慢的搖勻；12000 rpm，4C離心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新滅菌 的50ml抽提試管中；向上述抽提試管中加入12mL異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，有白色絮狀 沉淀析出，顛倒時注意往一個方向，防止沉淀散開，不利于后續(xù)實驗；將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出，至于2mL EP管中；向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反復(fù)輕輕震蕩洗滌，4C， 12000 rpm，高速離心15min，棄上清，重復(fù)此步驟兩次；將得到的白色沉淀再次4C

5、，12000 rpm短暫離心數(shù)秒，以移液器吸干 殘留乙醇；白色沉淀置于37C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，這 個過程中要經(jīng)常拿出觀察，防止過度烘干，不利于后面溶解；(11)待白色沉淀變透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液(pH8.0)， 放置于65C恒溫箱中，期間輕微彈勻，使DNA充分溶解；（12）DNA完全溶解后，加入5pL RNase（0.1mg/mL）,置于37C干燥箱中30min,消化RNA，取出3此，以1%瓊脂糖膠檢測是否有RNA殘留；（13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿，輕輕搖 勻；（14）4C，12000 rpm 高速離心 1

6、5min；（15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中，加入1/10體積（約0.07mL）NaAc（3M/L）溶液，輕輕搖勻；（16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇，輕輕搖勻后，于-20C 靜置20min；（17）4C，12000 rpm 高速離心 15min，棄上清；（18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次，去除殘留的乙醇；（19）白色沉淀置于37C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，該過 程中要經(jīng)常拿出觀察，防止烘干過度，不利于后面溶解；（20）待白色沉淀變透明，管中無殘留的乙醇味后，加入200pL TE（pH8.0）， 于37C干燥箱中溶解；（21）待DNA

7、完全溶解后，取出1pL，以分光光度計測定OD值，分裝后于保 存（-20C）。以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下：DNA提取過程中常見問題及建議解決方案:洗脫產(chǎn)物的DNA量很少所提樣品材料老化或應(yīng)選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組或沒有反復(fù)凍融導(dǎo)致基因組DNA含量下降織或幼嫩的植物組織等，不能即時處理的樣品應(yīng)立即放入液氮或 -70低溫保存，以免DNA降解。樣品破壁或裂解不完動、植物材料應(yīng)在液氮中充分研磨勻漿，G+細菌、酵母等破壁較困全導(dǎo)致基因組DNA未難的樣品應(yīng)用溶菌酶、酵母破壁酶或機械方式協(xié)助破壁，不同樣品充分釋放的細胞破壁方式可參照前面的詳細介紹。樣品量過多導(dǎo)致細胞加

8、樣量過多使裂解液和樣品混合不均勻，細胞裂解不充分。不同來裂解不充分源樣品的加樣量請參照詳細操作步驟。DNA吸附不充分如在上吸附柱前末加無水乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇，則 導(dǎo)致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不徹底，因此應(yīng)在樣品裂解 后加適量無水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。DNA洗脫不適當洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5 之間；洗脫體積若小于30p，則不易完全浸透硅膠膜，使DNA不能 全部洗脫下來，因此洗脫液體積應(yīng)大于30皿同時如洗脫液體積過 大，超過200皿則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減 少；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70C

9、水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在 室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產(chǎn)量。提取的基因選取的材料不新鮮或陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細胞凋亡導(dǎo)致DNA降解，組DNA有降 反復(fù)凍融，采集材料后或低溫保存的樣品反復(fù)凍融導(dǎo)致細胞破碎，內(nèi)源核酸酶降解DNA，解未及時處理或末低溫因此應(yīng)選擇新鮮的材料樣品，不能及時處理則低溫保存，運輸過程保存中亦應(yīng)使用干冰。未能有效抑制內(nèi)源核某些DNase含量較豐富的動、植物組織樣品應(yīng)在液氮中研磨或勻酸酶作用漿，研磨過程中應(yīng)隨時補充液氮，并在樣品末完全解凍前即加入含 有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。操作過于劇烈導(dǎo)致預(yù)處理的樣品加入細胞裂解液后，所有操作應(yīng)盡量柔和，避免振蕩、DNA被機打斷攪拌等劇烈機械力對DNA片段的損傷。提取的基因?qū)嶒炦^程中沒有有效應(yīng)嚴格按照實驗操作要求使用，即加入裂解液的同時加入20組DNA中有 使用RNase ARNase A溶液，室溫放置10分鐘。RNA污染RNAase A可能失活RNase A須在-20C下保存，低溫保存時RNase A比較穩(wěn)定，不易失活，但如果反復(fù)凍融會導(dǎo)致RNase A降解失活，所以應(yīng)妥善保存。提取的基因樣品量過多導(dǎo)致細胞樣品量過多會使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導(dǎo)致組DNA不能 裂解不充分樣品裂解不徹底，殘留大量蛋自、多糖、脂類等雜質(zhì)，為后續(xù)的上順利地進行吸附柱分離純化造成影響