馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫規(guī)程

1、馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫規(guī)程GB 7331871適用范圍本規(guī)程適用于各級原（良）種場、科研院校、集體單位和農(nóng)戶生產(chǎn)馬鈴薯種薯。2名詞解釋2.1產(chǎn)地檢疫指種薯生產(chǎn)過程中的全部檢疫工作，即4，5章規(guī)定的全部內(nèi)容。2.2脫毒種薯指通過莖尖脫毒培養(yǎng)方法，除去馬鈴薯花葉型、卷葉型、矮化型病毒（不包括束頂型）的脫毒核心材料（或脫毒苗）在隔離條件下生產(chǎn)的脫毒原原種、脫毒原種級種薯，并經(jīng)檢驗合格。2.3健康良種指按照5.3所列方法進行檢查和檢驗，未發(fā)現(xiàn)檢疫對象，控制病害發(fā)生率符合5.3.3所訂標準的種薯。3檢疫對象及控制病害3.1檢疫對象3.1.1馬鈴薯癌腫病Synchytrium endobioticum（S c

2、hilb）Per。3.1.2馬鈴薯環(huán)腐病Corynebacterium michiganense Pv. S epedonicum （S piechet K otth）S kaptet B urkh。3.2控制病害3.2.1馬鈴薯黑脛病Erwinia Carotovara Pv.atroseptica（rones）=Erwinia P hytophora（Appel）Holland。3.2.2馬鈴薯花葉型、卷葉型、矮化型病毒病。4種薯的生產(chǎn)4.1種薯地的選擇4.1.1種薯地應選在無檢疫對象發(fā)生的地區(qū)或輕發(fā)生地區(qū)的未發(fā)病地塊。 4.1.2留種地確定后，于播種前一月向所在地植檢部門申報并填寫“馬鈴

3、薯種薯產(chǎn)地檢疫申報表”（見表1）。表 1馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫申報表 申報單位聯(lián)系人繁殖地點 繁殖面積品種種薯（或核心材料）來源 播種時期 隔離條件 備注 注：申報表一式三份，一份交植檢部門、一份交種薯收購主管部門，一份存繁育單位（或農(nóng)戶）備查。4.2脫毒種薯的生產(chǎn)4.2.1脫毒核心材料的培育見附錄A（補充件）。4.2.2脫毒原原種的繁育見附錄B（補充件）。4.2.3脫毒原種級種薯的高倍繁殖。4.2.3.1必須選用附有產(chǎn)地檢疫合格證（引進的憑檢疫證書，下同）的脫毒原原種（或脫毒原種）為種薯。4.2.3.2播種一月前必須進行逐薯塊檢驗。方法見附錄C（補充件）。4.2.3.3檢驗合格的種薯用掰芽法繁育

4、。見附錄D（補充件）。4.3健康良種的生產(chǎn)4.3.1以脫毒良種（三代以下脫毒薯）或以三圃提純復壯后的優(yōu)良種薯為生產(chǎn)健康良種的種薯，均須附有產(chǎn)地檢疫合格證。4.3.2播種前將種薯在室內(nèi)晾710天，以汰除暴露出來的病薯。整薯播種選用4060g小整薯。4.3.3切塊播種的地方，必須進行切刀消毒。見附錄E（補充件）。4.3.4亦可選用夏播（或晚播）小種薯直接播種。4.4防疫措施4.4.1癌腫病發(fā)生區(qū)應采用以抗病品種為主的高廂畦植并徹底拔除隔生薯。 4.4.2疫情處理：發(fā)現(xiàn)本規(guī)程所列病害必須全部拔除病株，挖出已形成的種薯，深埋或燒毀。4.4.3藥劑防護4.4.3.1用25粉銹寧可濕性粉（或乳油）葉面噴霧

5、防治馬鈴薯癌腫病。 4.4.3.2治蚜。田間蚜蟲點片發(fā)生或有蚜株率5時，開始藥劑防治，每710天一次，共23次，防止病毒再侵染。4.4.3.3田間發(fā)現(xiàn)晚疫病“中心病株”，開始藥劑常規(guī)噴霧，保證田間檢查和疫情處理準確進行。4.4.4窖藏管理4.4.4.1入窖前嚴格汰除病、爛、傷、雜、劣種薯并經(jīng)常翻晾。4.4.4.2通風窖貯存，貯量不超過窖內(nèi)空間的三分之一。窖內(nèi)溫度保持在13為宜，相對濕度75左右。4.4.4.3“死窖”貯藏，冬季封好窖口，嚴防受凍或受熱爛種。5檢查和簽證5.1脫毒核心材料必須同時采用指示植物及血清檢驗（至少兩種以上血清方法），確認無病毒者簽發(fā)產(chǎn)地檢疫合格證（見表4）。檢驗方法見附

6、錄F（補充件）。5.2脫毒原原種和脫毒原種級種薯的檢查5.2.1每周肉眼檢查一次，若發(fā)現(xiàn)病株應及時拔除銷毀。對其周圍1m以內(nèi)的植株全部進行血清檢測以拔除隱癥病株。5.2.2收獲前一周，脫毒原原種順行每隔50株，脫毒原種級種薯順行每隔100株檢查一株，并進行血清檢驗以拔除隱癥病株。5.2.3對無檢疫對象和限制病害者發(fā)給產(chǎn)地檢疫合格證（見表4）。5.3健康良種的檢驗以田間檢驗為主，必要時進行室內(nèi)復檢。5.3.1田間檢查5.3.1.1檢查日期。分別于苗高67寸、盛花期和收獲前各檢查一次。 5.3.1.2檢查株數(shù)。在觀察全田的基礎上，根據(jù)不同面積隨機選點，一畝以下地塊檢查200株，一畝以上的地塊檢查總

7、株數(shù)不得少于500株。5.3.1.3癥狀鑒別、田間病株和薯塊癥狀，以肉眼觀察為主。見附錄H（參考件）。5.3.1.4檢查結果記入田間檢查記錄表（見表2）。表 2馬鈴薯田間檢查記錄表面積地點檢查項目檢查次數(shù)日期檢查方法檢查數(shù)量發(fā)現(xiàn)病株情況 調(diào)查點馬鈴薯癌腫病馬鈴薯環(huán)腐病馬鈴薯黑脛病馬鈴薯病毒病株（塊）株（塊）株（塊）株（塊）一二三薯塊檢查人員意見5.3.2室內(nèi)檢驗5.3.2.1田間不能確診的植株（或薯塊），采集標本作室內(nèi)檢驗。方法見附錄I（補充件）。5.3.2.2檢驗結果填入產(chǎn)地檢驗送檢標本報告單（見表3）。表 3產(chǎn)地檢驗送檢標本報告單送檢年 月 日 檢驗 年 月 日 標本編號 檢驗對象檢驗方法

8、檢驗結果檢驗人備注 5.3.3凡經(jīng)田間檢查和室內(nèi)檢驗未發(fā)現(xiàn)馬鈴薯癌腫?。蛔詈笠淮翁镩g檢查（含前兩次檢查曾發(fā)現(xiàn)病株已作徹底的疫情處理）未發(fā)現(xiàn)馬鈴薯環(huán)腐病；黑脛病病株率0.2以下，病毒病株率不超過10者可發(fā)給產(chǎn)地檢疫合格證（見表4）。表 4馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫合格證字第號 一九 年度繁育 品種（脫毒核心材料、原原種、原種級種薯、良種） 畝 萬斤（管）經(jīng)產(chǎn)地檢驗未發(fā)現(xiàn)檢疫對象，黑脛病株率 ，病毒病株率為 ，符合國家脫毒、健康種薯標準，準予作種用，特發(fā)此證。注：本證一式三聯(lián)，第一聯(lián)為存根；第二聯(lián)交制種單位（或農(nóng)戶）；第三聯(lián)交種子收購部門（或用戶）。本證書半年之內(nèi)有效，但只限本單位（戶）該批種薯使用，不得

9、轉借他人或弄虛作假，否則以違章調(diào)運論處。本證不作檢疫證書使用。5.4 其他要求5.4.1 以當?shù)刂脖＃ㄖ矙z）部門為主與種子管理和育種單位組成三結合產(chǎn)地檢查小組。5.4.2 詳細填寫馬鈴薯產(chǎn)地檢疫檔案卡片。見附錄G（補充件）。附錄A馬鈴薯脫毒核心材料的培育（補充件）A.1 器材與試劑WS-84-54手提式高壓滅菌鍋：280ml280ml，1個；無菌箱：1個；紫外燈：1個；酒精燈：1個；長鑷子：2個；棒狀溫度計：5只；40W日光燈：14只；培養(yǎng)架：一組；培養(yǎng)室：30m2；試管：20200，6000支；營養(yǎng)缽：6000個；聚氯乙烯塑料大棚：3050m2，一個；75酒精；甲醛；升汞；高錳酸鉀；解剖針；

10、漂白粉溶液；pH試紙；MS培養(yǎng)基：配制見下表。 MS培養(yǎng)基母液配制表母液化 合 物數(shù)量g 加蒸餾水量ml配制1L培養(yǎng)基需母液量mlA NH4NO3（硝酸銨） KNO3（硝酸鉀） KH2PO4（磷酸二氫鉀） MgSO47H2O（硫酸鎂） CaCl22H2O（氯化鈣）16.519.01.73.74.41000100BFeSO4（硫酸亞鐵） Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）0.5570.7451005CKI（碘化鉀） Na3NoO42H2O（鉬酸鈉） CoCl26H2O（氯化鈷） CuSO45H2O（硫酸銅） MnSO44H2O（硫酸錳） ZnSO47H2O（硫酸鋅） H3BO3（硼酸）0.08

11、30.0250.00250.00252.230.860.621001DEF 鹽酸硫胺素（B1） 鹽酸素（B2） 甘氨酸0.0040.0050.02100100100101010GH 菸酸 肌-肌醇 蔗糖 瓊脂 pH0.0051.030.07.05.81001001010直接加入直接加入注：在配制母液A時最后加氯化鈣。A.2操作程序A.2.1取剛出土幼苗或塊莖上的芽，切下12cm長一段，放在燒杯里，上面蓋好紗布，用自來水沖洗1h，然后移入無菌接種箱內(nèi)，浸泡在飽和漂白粉溶液中510min，取出后用無菌水沖洗23次。A.2.2將制備好的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)液分裝于試管，每管10ml，試管口用包紗布棉花球塞

12、緊，放入硫酸紙袋中（每袋1020支）在0.81kgf/cm2高壓鍋中消毒15min，冷卻后放入無菌接種箱待用。A.2.3操作前操作室、工作臺面、操作工具等用福爾馬林（甲醛）熏蒸，然后用紫外線照射2040min，工作人員著清潔工作服，手進入接種箱前用肥皂洗凈并用70乙醇擦拭消毒。A.2.4將幼苗切段放在40倍雙筒解剖顯微鏡下，用解剖針去掉幼葉，直至露出半光滑的生長點，用解剖刀從0.10.3mm處切下，接到試管內(nèi)培養(yǎng)基上，每個試管接三莖尖，接后在試管上端外面紙帽上注明處理和接種日期。A.2.5把接種好的試管從無菌箱中移出置于2125、光照30004000cd條件下培養(yǎng)。附錄B馬鈴薯脫毒原原種的繁育

13、（補充件）B.1器材與試劑同附錄A。B.2繁育材料經(jīng)檢驗合格的脫毒核心材料（試管苗，下同）若干管。B.3操作程序B.3.1將配備好的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)液分裝于試管中，每管10ml，放入高壓滅菌鍋滅菌處理15min，冷卻待用。B.3.2工作臺面和工具用70乙醇擦拭消毒；盛試管苗培養(yǎng)基的試管用1升汞表面消毒后放入無菌接種箱。B.3.3工作人員著清潔工作服，雙手用肥皂洗凈，伸入無菌箱后用70乙醇棉擦拭消毒，長把鑷子和剪子每次使用前都應在酒精上燃燒消毒。B.3.4把試管苗木植株按節(jié)剪斷，每顆帶一葉片，然后腋芽向上插于另一試管內(nèi)培養(yǎng)基上，烤干管口，用棉球塞緊管口。B.3.5插完的試管拿出無菌箱，用牛皮紙包好

14、管口，放于試管架上，在溫度2125，光照30004000cd條件下培養(yǎng)。B.3.6按細砂腐熟馬糞耕層熟土=153055配制營養(yǎng)土，分裝于營養(yǎng)缽中。B.3.7當試管內(nèi)小植株高510cm時，去掉紙帽和棉球煅煉12天，移植到缽內(nèi)，置于大棚內(nèi)在溫度20下假植。B.3.8假植苗株高1015cm時，放入網(wǎng)室定植。B.3.9加強水肥管理，發(fā)現(xiàn)蚜蟲即用11500樂果常規(guī)葉面噴霧，每隔7天噴1次，直到無蚜蟲為止。附錄C脫毒原原種的薯塊檢查（補充件）C.1設備和材料C.1.1培養(yǎng)室：30m2左右。C.1.2培養(yǎng)架：一組。C.1.3木制（或塑料）培養(yǎng)盤（如圖C1）若干個，每個60孔，每孔10cm2。圖 C1C.1.

15、4按無病土：腐熟糞肥：細砂721配制床土。床土含水量保持20左右。C.1.5白瓷盤（3050cm）一組。C.1.6小杯（口徑2.53.5cm）1000個左右。C.2操作程序C.2.1將配制好的床土裝入培養(yǎng)盤的小方格，每小方格裝床土五分之四以下。 C.2.2將應檢薯塊統(tǒng)一編號。C.2.3取每個薯塊的一個頂芽（如圖C2），放在白瓷盤相應編號位置的小杯內(nèi)，用0.3的2-氯乙醇液浸漬30min后，移入相應編號的培養(yǎng)盤方格內(nèi)。圖 C2C.2.4將培養(yǎng)盤移入培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上，培養(yǎng)室溫度維持在20左右，培養(yǎng)架應置于陽光充足的地方，適時澆水。C.2.5待薯芽長到2023cm時，逐株肉眼鑒定，病狀參照附錄H。發(fā)

16、現(xiàn)有病或疑似有病的相應薯塊應淘汰，有條件的可進行逐株血清檢測。附錄D原種級種薯的高倍繁殖（掰芽法）（補充件） D.1配制床土同附錄C中C.1.4。D.2操作程序D.2.1將種薯按芽切塊放在床土中，芽床溫度維持在1520，床土含水量為20左右。D.2.2薯芽長到45cm時掰下，插入營養(yǎng)缽里，母薯繼續(xù)在苗床催芽，一個芽眼可掰二次芽。操作時手用肥皂水洗干凈。D.2.3營養(yǎng)缽在常溫下，當苗長到15cm左右時，移入播種地定植生產(chǎn)一代以后種薯。D.2.4播種地選擇在500m內(nèi)無馬鈴薯主要病毒病寄主作物的地方。附錄E切刀消毒操作程序（補充件）E.1器材切刀：2把；搪瓷盆（或塑料盆）：2個；大筐（或席）：1個

17、（或一領）；消毒藥液：2000ml（0.1酸性升汞、0.1高錳酸鉀、75乙醇、5的碳酸任選一種即可）。E.2操作程序E.2.1將對好的藥液倒入盆中，將切刀柄朝上浸入藥液中。E.2.2先取出一把切刀，切完一個種薯，放回藥液；取另一把切刀，再切完一個種薯，又放回藥液。如此兩把刀不斷交替使用。E.2.3切薯塊時，邊切邊肉眼觀察切面，發(fā)現(xiàn)病薯或可疑薯塊全部淘汰。 E.2.4切好的薯塊放在清潔大筐里（或葦席上）備用。附錄F幾種主要馬鈴薯病毒的檢驗方法（補充件） F.1玻片點滴凝聚法（利用粗制抗血清）檢驗馬鈴薯PVX病毒F.1.1取被檢株中、上部葉片放入研缽中，再按11加入中性磷酸緩沖液研磨，用雙層紗布過

18、濾，濾液備用（也可用中性磷酸緩沖液浸濕紗布，折成雙層，包住樣品揉擠擰汁備用）。F.1.2用滴管吸取樣品汁液滴于載玻片上，左右各一滴。F.1.3取被0.85生理鹽水稀釋到5到10倍的抗血清和正常血清各一滴，抗血清滴于玻片右邊樣品汁液上，正常血清滴于左邊樣品汁液上，置于20左右的常溫下23min，若右邊汁液邊緣出現(xiàn)大塊凝聚顆粒，證明帶有X病毒，無凝聚顆粒證明被檢株無X病毒。F.2乳酸凝聚試驗把某一特異性的病毒抗血清中提純出的免疫球蛋白，吸附在均一的乳膠顆粒表面，當這種致敏的乳膠顆粒遇到相應的被鑒定抗原時，就會產(chǎn)生凝聚。F.2.1被檢植物汁液的榨取方法取供試樣品葉片約1g，按110（重量/容積）的比

19、例加入含0.85氯化鈉的0.1MTris鹽酸緩沖液，在研缽內(nèi)研碎。以3000r/min離心15min，取上清液供鑒定用。 或?qū)?g葉片樣品研碎，用一薄片脫脂棉擠壓過濾，用吸管吸取1滴汁液加入0.5ml的0.1MTris鹽酸緩沖液，供鑒定用。F.2.2用雙凹載玻片或用油筆在一般玻片上劃兩個圓圈，用滴管吸取被檢植物汁液滴在一側的凹中或圓圈上；用另一滴管吸取一滴陰性對照或陽性對照的汁液，滴在另一側。F.2.3吸取乳膠致敏的抗血清滴加在被檢植物汁液和對照的植物汁液上，輕輕搖動混勻。然后把玻片放到培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋。F.2.4把培養(yǎng)皿放置在23溫度條件下1530min，在這當中還可再輕輕搖動一、二次。有

20、微型振蕩機時，可把培養(yǎng)皿放置于振蕩機上振蕩。F.2.5用擴大鏡觀察，出現(xiàn)顆粒凝聚者為陽性，證明帶有X病毒；纖細的乳膠顆粒均勻分布者為陰性，證明被檢株無X病毒。F.3酶聯(lián)免疫吸附測定植株病毒（PSTV除外）F.3.1取被檢植株上部葉片（在馬鈴薯開花期）510g，加入中性磷酸緩沖液研磨，取汁液和包被緩沖液混勻，榨葉汁備用。F.3.2在編號的塑料微量多孔平底反應板上，每孔滴入200l被檢株汁液，在37下置2h（或4下24h），并設已知病毒為陽性對照，健康葉汁為陰性對照。F.3.3棄包被液后，每孔用洗滌緩沖液漂洗三次，每次5min。F.3.4去洗液后每孔加稀釋好的（稀釋液為生理鹽水，稀釋23倍）抗血清

21、200l，在37下置2h。F.3.5去血清后按F.3.3洗滌三次。F.3.6每孔加經(jīng)稀釋5080倍的酶標血清200l，在37下置2h。F.3.7棄酶標后按F.3.3洗滌三次。F.3.8去洗液后每孔加入200l底物緩沖液，在37下置1545min。F.3.9每孔加入50l2M硫酸終止反應。F.3.10小孔內(nèi)出現(xiàn)黃褐色反應為陽性，被檢株帶病毒。注：底物緩沖液的配法：A液：0.1M檸檬酸2.00ml；B液：0.2M磷酸氫鈉200ml；30雙氧水80l；鄰苯二胺20mg。底物緩沖液24.3mlA液25.7mlB液80l雙氧水20mg鄰苯二胺。 包被緩沖液：1.59g炭酸鈉+2.93g炭酸氫鈉+1000

22、ml水調(diào)pH=9.6。稀釋緩沖液：8g氯化鈉0.2g磷酸二氫鉀2.9gNa2HPO412H2O1000ml水調(diào)pH7.4，再加0.2g氯化鉀，0.5mlTween20混合后，從中取100ml加1g牛血清蛋白，4貯存。洗滌緩沖液（PBS-Tween-20）：8g氯化鈉+0.2g磷酸二氫鉀+2.9gNa2HPO412H2O0.2g氯化鉀0.5mlTween20水1000ml，調(diào)pH7.4。F.4利用鑒別寄主檢驗X、Y、S、G、A、M、PSTV病毒F.4.1在20左右，防蚜條件下盆栽千日紅、心葉煙、香料煙和莨菪若干。 F.4.2按F.1.1制備被檢汁液。F.4.3用汁液摩擦接種法先在指示植物葉片上用

23、小型噴粉器輕輕噴上一層金崗砂（400篩目），然后用已消毒的棉球沾被檢株葉或芽汁，在指示植物葉片上輕輕摩擦，用清水洗掉葉片上的雜物，置于2024左右，37天后逐日觀察癥狀。馬鈴薯病毒在主要指示植物上的癥狀 檢測病毒 接毒后檢查時間 指示植物 表 現(xiàn) 癥 狀 PVXPVMPVSPVGPVYPVAPSTV57天1224天1425天20天710天710天515天千日紅千日紅千日紅心葉煙普通煙香料煙莨菪 葉片出現(xiàn)紅環(huán)枯斑 接種葉片出現(xiàn)紫紅色小圓枯斑 接種葉片出現(xiàn)桔紅色小斑點，略微凸出的圓或不規(guī)則小斑點 系統(tǒng)白斑花葉癥 初期明脈，后期沿脈出現(xiàn)紋帶 微明脈 沿脈出現(xiàn)褐色壞死斑點F.5利用苯酚測定PLRV（卷

24、葉病毒）F.5.1按F.1.1制備被檢株汁液。F.5.2取被檢汁5g放入清潔指形管，并加入5ml6苯酚溶液，搖勻后靜置510min到葉綠素和細胞殘體沉淀為止。F.5.3去掉上層液體，在沉淀物里加入5ml清水。F.5.4觀察結果若產(chǎn)生沉淀液，表示被檢株不帶PLRV，產(chǎn)生混濁液表示被檢株帶有PLRV。 附錄G馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫檔案卡片（補充件） 馬鈴薯種薯產(chǎn)地檢疫檔案卡片見下表。地塊檢查年 月 日 品種 種薯來源播種日期消毒辦法 田間檢驗 室內(nèi)檢驗檢查人 病害株率株 結果 附錄H馬鈴薯病害田間癥狀鑒別（參考件） 馬鈴薯病害田間癥狀鑒別見下表。 發(fā)病部位 馬鈴薯癌腫病馬鈴薯環(huán)腐病馬鈴薯黑脛病馬 鈴

25、薯 病 毒 病 卷葉型花葉型矮化型束頂型莖葉在高度感病的品種中主枝與分枝、分枝與分枝或枝葉的腋芽、莖尖等處，長出一團團密積的卷葉狀組織的瘤，形似花葉菜花，綠色，后變褐，最后變黑腐爛脫落，莖桿、花梗上和葉背、花萼背面長出無葉柄、綠色、有主脈無枝脈的叢生小葉現(xiàn)蕾后陸續(xù)出現(xiàn)萎型，頂葉變小，葉緣向上卷曲，葉色變淡呈灰綠，莖桿一株或數(shù)枝萎垂倒黃化枯死，但枯死后葉片不脫落苗期67寸始表現(xiàn)植株矮化，葉片退綠黃化，莖部呈黑腐，表皮組織破裂，后期形成“黑腳”，極易從土壤中拔除葉片向上卷曲，變厚，呈匙狀，質(zhì)地硬脆。個別品種病變處呈紫紅色或退綠變黃。注意經(jīng)卷葉（頂部顯癥）沿中脈包起來。嚴重的矮化（減產(chǎn)80左右）。有時有復合侵染，紫點加卷葉葉片表現(xiàn)退綠區(qū)域或黃