三個MADS盒基因類似于來自白樺(微生物學(xué)鴨蹠草)的APETALA1和FRUITFULL基因解讀

1、三個MAD/基因類似于來自白樺(微生物學(xué)鴨賺草)的APETALA1 和FRUITFUL基因Annakaisa Elo*, Juha Lemmetyinen, Marja-Leena Turunen, Liisa Tikka and Tuomas Sopanenf芬蘭，F(xiàn)IN - 80101約恩蘇，約恩蘇大學(xué)，生物系，郵政信箱111*通訊作者，電子郵件：annakaisa.elo joensuu.fi2000年1月24日收到；200妙6月29日修訂盡管在花發(fā)育的基因調(diào)控方面有了深入的研究但在多年生植物早期階段的研究仍然很少，例如樹。本研究的目的是確定白樺樹 (微生物學(xué)羅斯鴨蹦草)花序發(fā)育初期的基

2、因調(diào)控以及解釋在白 樺單性花序發(fā)育中這些基因的表達(dá)。在這里我們描述3個cDNAs克隆和特征來代表 MADS-bo避因命名為BpMADSBpMADS口 BpMADS所有屬于植物 MADS-bo海因AP1/ SQUA.。 根據(jù)RNAK酸 雜交分析，所有這3個基因在雄性和雌性花序發(fā)育過程中都是活躍的。然而，不同的表達(dá)模式表明它們發(fā)揮不同的作用。BpMADS3序列上與 AP即SQUAt為相似，但它似乎在后期發(fā)展階段具有最高表達(dá)量。BpMADSE序列上與擬南芥 FRUITFUL溟因最為相似，但表達(dá)在除了花序發(fā)育外的 芽與卞Ho BpMADST FRUITFUL此相似，其表現(xiàn)似乎在果實(shí)發(fā)育的花序特殊性與連

3、續(xù)性上。在煙草無論BpMADSBpMAD BpMADSf CaMV35 S啟動子的異位表達(dá)將會引起非常早期的開花。所有的這些樺木基因似乎都影響早期階段和生殖過渡期，可能參與確定身份的花序或花分生組織。 他們在各種植物物種中顯然能夠被用來促進(jìn)開花的。刖百早期階段生殖發(fā)育的基因調(diào)控已經(jīng)主要在對擬南芥和金魚草的研究中闡明(Yanofsky 1995)。在擬南芥中，最早的基因表達(dá)于誘導(dǎo)開花后的莖尖分生組織，包括FRUITFULL ( FUL,formerlyAGL8),和擬南芥的近親屬芥中的 SaMADSA 和口(Mandel and Yanofsky 1995a, Menzel et al. 199

4、6, Bonhomme et al. 1997 )?；ㄐ蚍稚M織已經(jīng)形成后，花的分生組織的形成需要一些基因的參與，如LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1)和 CAULIFLOWER (CAL) (Mandel et al. 1992, Weigel et al. 1992,Kempin et al. 1995)。AP1和CAL也和FUL 一起在形成花序架構(gòu)過程中有很多的參與，如 FUL , 通過調(diào)控LFY的表達(dá)(Ferrandiz et al. 2000)。這些基因也參與其中，包括在擬南芥中的APETALA2 ,PISTILLATA , APETALA3和AGAMOUS ,無論

5、是直接或間接的激活的同源基因，它們決定花器官 的特征(Yanofsky 1995 年)。多數(shù)基因調(diào)節(jié)花發(fā)育的早期階段，包括MADS-BOXS基因家族的成員AP1, CAL andFUL (Yanofsky 1995)。除了高度保守的 MADS域含有57個氨基酸外，在一個典型的植物 MADS蛋 白包含一個I區(qū)(30-40個氨基酸)，跟隨于一個適度保守的K區(qū)(約66個氨基酸)和相對較低保守的？末端區(qū)域。該 MADS域蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制其他基因(Schwarz-Sommer et al.1992, Riechmann and Meyerowitz 1997)。 一般來說，植物MADS -

6、box基因可分為幾個不同的亞科，在成花過程中成員有著相似的功能（Purugganan et al. 1995, Thei?en et al. 1996）。我們已經(jīng)了對 白樺樹（微生物學(xué)鴨蹦草）成花發(fā)育的研究。從系統(tǒng)發(fā)育角度，樺木家族在主 要雙子葉植物核心分支下屬于高級金縷梅綱的次級分支（Manos and Steele 1997, Magallo n et al.1999）, “高等”金縷梅綱的代表有典型的風(fēng)媒花和高度退化的花。樺木有雌雄分離的單性花序。雄性花有一個簡單的花被和兩個雄蕊組成，而雌花則只由一個子房和兩個心皮構(gòu)成（Atkinson 1992,Dahl and Fredrikson

7、1996）。雄性花序發(fā)育在開花之前開始于一年中的早春期，在芬蘭，大致出現(xiàn) 在盛夏，有2-4mm長（Sarvas 1952）。雌性花序的發(fā)育在 6月到7月之間；位于芽內(nèi)越冬，并于 5 月開花。我們的目的是了解一些在很多北方區(qū)域的經(jīng)濟(jì)重要林木白樺花發(fā)育的遺傳調(diào)控的方面。另外 一個目的是利用獲得的知識研發(fā)不開花樺樹。因?yàn)樗械幕蚵釉谧匀环N群中的后果是難以預(yù) 測的，所以在它們被測試到在自然中生長之前需要防止轉(zhuǎn)基因樹木的開花（Strauss et al. 1995）。論另一方面，加速開花，這將是可取的，例如，加快育種計劃。本研究的目的是在樺樹中確定花序和花發(fā)育早期階段的基因調(diào)節(jié)。我們描述這3個cDN

8、A的克隆與性征，它們都表現(xiàn)出與 AP1和FUL的相似性。我們想要找出這些基因是否在雌性和雄性花 序中表達(dá)，它們什么時候處于活躍以及它們與其他未知的植物MADS-box基因有怎樣的聯(lián)系。我們也希望通過它們在煙草植物中的表達(dá)初步探知它們的功能。材料與方法植物材料在用不同發(fā)育階段的幾種野生白樺樹（微生物學(xué)鴨蹦草）雌雄花序或花序（雄）芽。最早的雄性柔美花序采自六月份的并采2-4毫米長，下一階段（7毫米）收集在七月而第三階段（約 20毫米）在八月。雄蕊的似乎在花序長7毫米時發(fā)育的很好，并在秋天幾乎完全發(fā)育完成。處于休眠狀態(tài)的雄性花序采于一月份。當(dāng)雄性花序約50毫米長，開花期發(fā)生在5月初。在九月收集第一個

9、樣品的雌花序，它們處于萌芽狀態(tài)約4毫米長。在這個階段，心皮的芽清晰可見。在冬天休眠期間，心皮發(fā)育良好，并在春季，心皮增大。休眠期雌花序的樣本是在一月采集，接著進(jìn)一步樣 品采于它們在四月出芽（長度10毫米），和在5月的開花時期（約 20毫米長度）。最后的樣本收集于花序發(fā)展成種子的六月。營養(yǎng)器官（根、葉及約5毫米的頂芽，有緊密的植物分生組織）分離自長在試管內(nèi)的約為 10厘米長的生長莖。樣品進(jìn)行了液氮冷凍和儲存在。C環(huán)境中。RNA的分離和RNA的凝膠印跡分析用Friemann et al. （1992）.的方法分離得到白樺組織的總RNA。對RNA樣品的量和純度進(jìn)行分光光度計和凝膠澳化染色電泳進(jìn)行檢測

10、。本樣品（10毫克）在甲醛瓊脂糖凝膠進(jìn)行粒度分級電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜（MSI）并在緩沖液中在 42 C下與標(biāo)記有P32的探針進(jìn)行雜交（5 SSPE, 50% 甲酰胺，5Denhardt 溶液，0.2%十二烷基硫酸鈉，100毫克每毫升變性脫氧核糖核酸）。然后用0.2SSPE和0.5%十二烷基硫酸鈉在 65 C清洗。探針基因具有特異性，BpMADS3有480-nt 片段，BpMADS4有290-nt片段和BpMADS5有350-nt片段從cDNA克隆基因的3端包括部分 C 區(qū)的3末端和整個3的非編碼區(qū)。所有的探針標(biāo)記使用隨機(jī)引物標(biāo)記程序(試劑澳酚藍(lán)，瑞典烏 普薩拉)。轉(zhuǎn)基因煙草植物中總RNA的分離使

11、用總RNA 提取試劑盒(Qiagen GmbH, Hilden,Germany).。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)用于分離部分基因克隆相應(yīng)的白樺MADS - box基因。用Friemann et al. (1992)的方法從雌性(2 - 4毫米)和雄性(2 - 10毫米)花序中分離得到總RNA。第一鏈cDNA的合成使用第一鏈合成試劑盒(蛋白質(zhì)純化手冊生物技術(shù))。部分基因?qū)?yīng)到BPMADS3 , 4 和 5 得到了 RT - PCR 使用部分簡并寡核甘酸 MX2U, 5%-GTI(TC)TITG(TC)GA(TC)GCIGA(AG)GT-3% 成相應(yīng)的肽序列到 MADS

12、 盒肽序列 VLCDAE 的 地區(qū)連同寡D (T) (18 - MER)。聚合酶鏈反應(yīng)的條件如下：初始變性在96 2分鐘，其次是35個周期的94為1分鐘，45 C1分30秒和72c為1分30秒。最后延伸溫度 72c 5分鐘。所有的 PCR反應(yīng)采用 TBR聚合酶(Dynazyme, Finnzymes Inc., Espoo, Finland )。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入質(zhì)粒 pUC 18載體，并測序。構(gòu)建及篩選文庫從雌性柔K花序開花前(約15毫米長)和早期發(fā)育的雌性柔K花序(2Y毫米長)用poly(A)RNA分離構(gòu)建2個cDNA文庫。文庫的構(gòu)建ZAPII制成使用基因合成試劑盒(蛋白質(zhì)純化手冊和生物技術(shù))

13、和 GigapackII黃金克隆試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA,USA)。用部分cDNA 特性反應(yīng)制成探針用以對上述基因的篩選。顯然，全長 cDNA克隆對應(yīng)的BpMADS3和5從成熟 雌性柔K花序的篩選文庫中獲得而cDNA克隆對應(yīng)的BpMADS4是從幼嫩雌花序的篩選文庫中得到。含有目cDNA的pbluescript質(zhì)?；蚶肍1輔助噬菌體從噬菌體中被成功分離(Stratagene)。測序和序列分析所有測序反應(yīng)用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行使用T7測序試劑盒(蛋白質(zhì)純化手冊生物技術(shù))。兩股孤立的cDNA單鏈分別測序。核酸和氨基酸序列分析使用采用圖文影像包發(fā)布10.0 (遺傳學(xué)電

14、腦集團(tuán)，公司，麥迪遜，威斯康星州，美國) 。序列數(shù)據(jù)庫用來與序列BpMADS3, 4和5進(jìn)行比對。氨基酸和核甘酸序列的比對都由CLUSTAL W 程序來完成，清晰精致的視圖使得以氨基酸和核昔酸序列能夠做很好的分析。距離計算進(jìn)彳T了使用 Tajima and Nei (1984)的分子進(jìn)化遺傳算法分析軟件包版本1.02(Kumar et al. 1994)。距離計算是采用只有第一和二密碼子的位置。進(jìn)化樹卞建是500個輔助重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 使用鄰接方法(Saitou和Nei, 1987)與云杉基因DAL 1 (tandre等人，1995) 和核桃基因PrMADS3 (mouradov等人，1998

15、)作為外類群。煙草轉(zhuǎn)化cDNA克隆基因在質(zhì)粒 pHTT602中CaMV 35S啟動子的控制下包含有 BpMADS3,4和5的整 個編碼區(qū)。質(zhì)粒 PHTT602類似于PHTT370 ( Elomaa et al. 1993)。除了已經(jīng)加入 npt-II基因插入（T. H. Teeri）。嵌合質(zhì)粒通過三親交配（ Van Haute等人，1983）被轉(zhuǎn)移到含有 Ti質(zhì)粒pgv2260 （Deblaere 等人，1985）的農(nóng)桿菌菌株 c58 （Van Larebeke 等人，1974）中。煙草葉盤（Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1）轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)方法（H

16、orsch等人，1985）,選擇利用卡那霉素進(jìn)行轉(zhuǎn) 基因植物。在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物。結(jié)果分離及BpMADS3, BpMADS4和BpMADS5序歹U分析利用RT - PCR方法，3種來自樺木的不同的 MADs-box包含的部分基因克隆進(jìn)行分離和測序。從2個cDNA篩選文庫中獲得了相應(yīng)的全長基因克隆。相互分離的基因克隆代表命名為BpMADS3 ,BpMADS4和BpMADS5 （微生物學(xué)鴨蹦草 MADS ）。3個克隆都含有一個有 3和5的測區(qū)和側(cè)翼 ployA尾巴的開放閱讀框。所有克隆都有 MADs盒的一個ATG密碼子近端。核甘酸序列的cDNA克隆有以下的 EMBL 登錄號：BpMAD

17、S3, X99653; BpMADS4, X99654; BpMADS5, X99655。在氨基 酸水平的序列比較（圖1）顯示高度的相似性。一致性介于68-72%,相似性為78 - 79%。所有3個序列與 AP1有66-74%的一致性以及 77 - 83%的相似性，與FUL有60 - 71%一致性69 - 77%相 似性（圖1）。在分類學(xué)上，樺木屬于一個主要rosid分支，但與擬南芥屬（十字花科；白花菜目）在不同的亞分支，而例如，煙草和金魚屬于其他雙子葉植物的主要分支（ magallo等，1999）。在 這個條件比較下，樺木和蘋果（海棠；薔薇科）基因被認(rèn)為有相當(dāng)高的相似性，BpMADS3與Md

18、MADS5相似（85%相似）和BpPMADS5和MdMADS2相似（84%的相似性，如圖 2所示），兩 種物種都屬于核心 Rosids。API BpMADSjFUL EpMADSS BpMADSJA GI s I I S1 SI SDAEV A LI D A E V AB D A E V A L D A E V A L D A E V A LK G K L F K G K L F KG KL F KG KL F X G KL FH H s T TE S T D E 0T D E Y S T D E Y S T DSB Sei 口 D D L L L L L D,DD 口 D E 0 3 3 K

19、I GG.GlGa L LSL Y F F LTY F H H Fo o o o o2 2 2 2 2 11111ryerysya RY E RY S YA R YR Y0V0O RYiiRYSYAD RYERYSVADQ LQ L V AQ L RQLClAPIEpMADSJFULBpKAC-SS BpHADSSGRGKVCLKRIENKI CUGRVCLKRtENKI GRGRVCLKRI3NKI GRGRVCLKRtENKI grcrvclkrieukiE E E E* M M M M clc cs s s s 5p A R N TAPIBpHADS3 FUL 即MAD55 BpMADS

20、iR K R K NAPI BpMAD53FUL BpMADS5 BpMADSi圖1 BpMADS3, BpMADS4和BpMADS5與API和FUL的同源氨基酸比對圖。這比對是使用PILEUP和PRETTYBOX程序包的圖文影像。相同的氨基酸是描為黑色，相似的氨基酸為深灰色，有點(diǎn)相似序列為淺灰色。點(diǎn)表示空白。jIPJ (Arabtdflpxh) Hailapl (Hrtkififeii) Tini 之ip 1 (iirwixiuu) Baapl (flrasxica/ SaMADSC (Sinapix) CAL (Atubidupsis) BuGii (Tt/usxica) MJMADS5

21、(Miilux) QpMADS3 (HeMi) NAP12 (NlcoUanu) SQUA (Antirrhinum 3LM4 (Siltina) FTMl fSolurium) 咖4叩町Ffc網(wǎng) 及4P； 7SXJW5 (Sflene) 肛3EW4 (Biitula) bapi (Eiiat/ypfus) EAP2 (Eucalyptus) AQL8 (Arabidcpsf SflJlAPEF (Sinapis) MciMAnS2 (Mttiufi) BpMADSb (Htiiiila) ZAP1 (Zsa)SbMADS2 (Sorghum) TAMAD311 (Triticum) VALI

22、 (Plcta) PrMAUSJ (Ptnus)圖2不同植物蛋白序列的進(jìn)化樹建立3個不同樺木基因和來自其他植物物種的已報告基因的相關(guān)性，并預(yù)測不同樺木基因可 能的功能同源性，我們制作了一個屬于AP1:SQUA分支和 AP1:AGL9亞家族的序列比對(Purugganan等，1995)。需要用到整個編碼序列。這個比對是用來指導(dǎo)構(gòu)建進(jìn)化樹的(圖 2)。AP1分支包含有像 API, CAL, FUL等來自擬南芥和 SQUA等從金魚草以及相關(guān)其他物種的 基因。所有 AP1分支的成員 在I區(qū)留有61-77個編碼一個假定高度保守的共識蛋白序列的SCMEK:RILERYERYSY AE(圖1)。這個序列甚至

23、在 AP1和AGL9分支都有很大的不同的，它們都被認(rèn)為屬于 MADS - box基因的同一家族(Purugganan等人，1995)。因此，這個模似乎是處于API : FUL的祖先譜系之間，它偏離 AGL9超過300mya （Purugganan等人，1997）。這雙子葉植物基因分為 2個小組（圖2）。第一組包括樺木基因 BpMADS3 ,例如，擬南芥基 因AP1和CAL和其他植物同源性基因。第二小組包括，除了樺木BpMADS4和5,例如，擬南芥FUL基因，和形成自己獨(dú)特分支的單子葉植物基因，像是一個祖先直系的雙子葉植物API : FUL。進(jìn)一步的重復(fù)發(fā)生在 AP1和FUL的譜系，例如，CAL

24、來自一個十字花科的重復(fù) AP1的譜系，同 樣BPMADS4和5也似乎來自從同一祖先基因。與AP1和FUL高度相似的成員，也可以通過診斷在 K-域和在C -末端的預(yù)測蛋白質(zhì)序列來區(qū) 分（圖1）。AP1 像包括，例如， CAL, SQUAHE和BpMADS3的基因，通常編碼保守序列94-106個K域SMEYNRLKAKIEL ,而FUL基因編碼不同的序列，TLEHAKLKARLEV 。由3個單子葉植物編碼的序列 CHEYRLKAKIET 與AP1基因編碼的十分相似。AP1組的成員基因在最后 22個殘留的預(yù)測蛋白也是高度保守的。這一區(qū)域顯示一個LDLTLEVYNCNLGCFAA共識序列。在C末端，假

25、定FUL蛋白質(zhì)有一個非常不同的保守序列，LLPPWMLRHLN ,尤其是終止密碼子之前在8-10殘留堿基的色氨酸十分保守。單子葉植物的代表，ZAP1和TaMADS11,似乎編碼FUL序列為它的C -末端，這意味著這一序列起源于同一個祖先。該預(yù)測蛋白質(zhì)序列的相似性比 對類似于 AP1 : FUL 是有效的（http： HYPERLINK http:/www.joensuu.fi www.joensuu.fi : sopanen）。BpMADS3, BpMADS4 和 BpMADS5 的表達(dá)為了檢測基因的表達(dá)模式，我們用 BpMADS3, BpMADS4 and BpMADS5的特異性3末端探針

26、進(jìn)彳T RNA雜交印跡分析（使用核酸雜交分析測試） 。3個探針雜交基因在 cDNA的基礎(chǔ)上判斷 mRNA的大小。BpMADS3的相應(yīng)記錄同時體現(xiàn)在雌性和雄性花序中（圖3）。在雌性花序，在早期階段表達(dá)微弱但在當(dāng)花序漸漸長大和花朵漸漸開放的休眠期和冬天表達(dá)量很高。在開花之后的種子成長發(fā) 育期，表達(dá)量繼續(xù)在相當(dāng)高的水平。雄花序在年輕的階段大量表達(dá)（圖 3不可見），在一月的休眠 期沒有可用記錄，但在春天有記錄表達(dá)水平在此增加，在花期達(dá)到最大。植物莖尖檢測到了相當(dāng) 弱的表達(dá)。BpMADS4也同樣在雌性和雄性花序中表達(dá)，并根據(jù)信號的強(qiáng)度它的表達(dá)似乎高于BpMADS3和5 （圖3）。在年輕的階段表達(dá)就已經(jīng)很

27、強(qiáng)烈，并在發(fā)育過程中持續(xù)高水平表達(dá)。有一個葉片， 植物莖尖和根部表達(dá)量的探測器，在休眠和開花以及種子發(fā)育過程都有表達(dá)量的記錄。BpMADS5的雌花序有著比雄花序更高水平的表達(dá)（圖3）。在這兩種類型的花序中的表達(dá)開始在早期階段，此后繼續(xù)在相當(dāng)高的水平。大量的記錄也出現(xiàn)在休眠雌花序。雄花序在開花期的 高水平表達(dá)就像雌性花序在種子發(fā)育過程中的表達(dá)。植物營養(yǎng)部分沒有檢測到任何表達(dá)。Male infLFemale in fl .告二 QW6 M.E4q 總房 EE ON曾尋wcaEJOa 0 %前uuds caEJOa EE ONPEBpMADSJBpMADS4BpMADSS 28S圖3樺木BpMADS

28、3、BpMADS4和BpMADS5表達(dá)的雜交印跡比較 。從雄性和雌性的不同花序分離發(fā)育階 段以及從植物各部分（根、葉、莖尖）取得總 RNA樣品（10毫克）。與核糖體28S探針的雜交被用來作為 RNA的負(fù)荷控制。每個探針使用相同的凝膠印跡。異位表達(dá)煙草為了得到這些分離基因的相關(guān)初步認(rèn)識，它們受CaM V35S啟動子的控制下在煙草中異位表達(dá)。每個構(gòu)建試試驗(yàn)中， 培養(yǎng)10-15個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株種植，其中至少有三分之一個明顯的表型的改變。由這3個基因所引起的表型的改變是相當(dāng)類似的，最顯著的特點(diǎn)是早期開花（圖4）。早期開花型繼承以自交后代。獨(dú)立的后代顯示表型變化，但每個試驗(yàn)最早的植物開花在3-5片葉，6

29、-20厘米高之后，純植物開花早于雜合子。溫和型植株在5 - 10片葉，30- 50厘米高之后開花。轉(zhuǎn)基因植株明顯的表型總結(jié)與表一。核酸雜交分析證實(shí)了這些轉(zhuǎn)基因植株在葉子和花中的表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。沒有野生型植物無論體外培養(yǎng)或種子培養(yǎng)在24片葉和115厘米高度之前開花的（表1）。早花煙草植物通常是較小且葉子為深綠色，就像野生型煙草花序的葉子?；ǖ慕Y(jié)構(gòu)和花序組 織看起來是正常的。所有的早花植物自交產(chǎn)生十分飽滿的種子而且這些早花表型穩(wěn)定遺傳到后代。煙草植株接受不同樺木基因也顯示出一些表型的差異。植物接受BpMADS3表現(xiàn)出短節(jié)間導(dǎo)致植物矮小（5-30厘米，表1）,強(qiáng)大的表型產(chǎn)生的花序布滿每一個腋芽（

30、條）。植物接受BpMADS 4有小，窄，深綠色的葉子和纖細(xì)靈活的莖節(jié)間（圖4）。植物表達(dá) BpMADS 5相比BpMADS3和BpMADS4植物或多或少處于中間狀態(tài)。圖4、轉(zhuǎn)基因煙草植株樺樹基因異位表達(dá)BpMADS3和BpMADS4。A :早期開花BpMADS4表達(dá)煙草植物（左）和舊野生型對照植株（右）。B:典型的初花期BpMADS3 -表達(dá)煙草（T1 ）花序芽增長早期的葉腋。這種植物的高度在10厘米時，第一朵花開放。C:典型的初花期 BpMADS4表達(dá)煙草（T1 ）修長的外觀。表格一、煙草植株不同基因 BpMADS3, BpMADS4和BpMADS5表達(dá)的表型Transgenic lineP

31、lant heightNumber of leavesInUmode length (cm)展地四DSJ 18,3 1.5415 0,5919.0 466lUO.jB27,0 + 10.064.0+1.5BpMADSi 236,5 1 1566,0 1.5i29,S1.054,8 f 1,9捶S125 + 2.07L50.8Control119.0 15y4.8 t l.j討論在這里我們闡述了從樺樹得到的MADs-box的3個基因的克隆，BpMADS3, BpMADS4和BpMADS5,它們屬于 AP1/SQUA分支和 AP1/AGL9的亞家族。不同成員的植物MADS - box基因家族編碼的

32、蛋白質(zhì)具有高度相似類域。它們的功能像同源或異源二聚體和域，I區(qū)，以及K域似乎都參與形成二聚體 （Huang等，1996, Riechmann等，1996）。I區(qū)的第一個23個堿基的氨基酸 在MADs蛋白家族代表了各種不同的亞單位，它們暗示了功能的重要性。例如，根據(jù)我們的比較AP1/FUL基因序列共享了保守序列 MEKRLERYERYSY 而，例如，AG單位的成員共享序列 的ANNSVK : RTIERYKKA （Purugganan 等人，1995, Tandre 等人，1995）。序列功能的重要 性是由相當(dāng)大的差異進(jìn)一步支持的，甚至在 AP1和AGL9的分支之間也就存在著巨大的差異。在高度相

33、似的AP1和FUL的成員之間的最大差異似乎存在于K域的起始部分，尤其是在C -末端，可在診斷特異性序列時發(fā)現(xiàn)。這同樣適用于AP3/PI域（Kramer等，1998）,還可能涉及的運(yùn)作的C -末端類似于AP1中的轉(zhuǎn)錄激活域（Cho等人，1999）雖然在此研究的樺木基因序列非常相似，但是它們的表達(dá)是不同的。然而，它們，在雌性和 雄性花序中都有表達(dá)，因此，他們不可能參與確定花的性別。在冬天休眠期的花序的相關(guān)記錄也 明顯說明了，這可能是花在春天的一個快速成熟的優(yōu)勢。系統(tǒng)發(fā)育分析，BpMADS3與AP1在一些主要區(qū)域相關(guān)（圖 2）,這是為花分生組織的形成以 及為發(fā)展萼片和花瓣所需要的（Mandel等人，

34、1992, gustafson-brown 等人，1994, Mandel andYanofsky, 1995 b）。然而，相對于 AP1, BpMADS3的表達(dá)似乎在后期階段的花發(fā)展和種子發(fā)育過 程中更強(qiáng)大（圖 3）。BpMADS4在花序發(fā)育早期階段強(qiáng)烈表達(dá)（圖3）。BpMADS4類似擬南芥基因FUL ,核糖核酸在花序分生、枝和莖葉組織積累，在花形成的最初階段被排除在花分生組織（曼德爾和亞諾夫斯基1995年）。FUL似乎在維護(hù)花分生組織的特異性和連同 AP1和CAL調(diào)控花序結(jié)構(gòu)（ferra ndiz 等人，2000）。正常的莖葉果實(shí)發(fā)育也需要 FUL （Gu等人，1998）。芥基因的Sa-M

35、ADSB似乎與 FUL有密切的同源性及類似的表達(dá)模式 （Menzel等人，1996）。一些系統(tǒng)遙遠(yuǎn)的 MADS - box基因，AGL12, AGL14和AGL17像BpMADS4一樣在根部表達(dá)，但在對比BpMADS4,他們不在花序表達(dá)（Rounsley 等人，1995）。在序列水平，BpMADS5與BpMADS4是相當(dāng)類似的，但比起 BpMADS4更接近FUL （圖2）。 BpMADS5主要是在早期發(fā)展的花序表達(dá)（圖3）,而不是植物營養(yǎng)組織。這可能是重復(fù)一個祖先FUL基因譜系導(dǎo)致雙功能基因，BpMADS4和5,都沒有保留所有原始FUL的功能。不過，早期的表達(dá)表明這兩個基因的表達(dá)可能像FUL 一樣已經(jīng)在花序分生組織發(fā)揮作用。（Mandel andYanofsky , 1995 年）該分離基因的功能無法通過與比較類似的基因和其他植物或由核糖核酸凝膠印跡分析準(zhǔn)確預(yù) 測。整個花序已采取核糖核酸凝膠印跡分析，包括軸以及